Questo protocollo è rilevante per l'isolamento delle cellule endoteliali da campioni di tessuto o pezzi molto piccoli di vasi sanguigni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere riprodotta in qualsiasi laboratorio di ricerca e permette di ottenere una buona purezza delle cellule endoteliali, anche da campioni molto piccoli. Iniziare a preparare il campione di parenchima polmonare lavando i campioni raccolti in un tubo da 50 millilitri contenente PBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, o PBS meno meno.
Trasferire i campioni in una piastra di Petri sterile e tritare manualmente in piccoli frammenti di circa tre o quattro millimetri usando le forbici chirurgiche. Per il segmento dell'arteria, lavare i campioni raccolti in un tubo da 50 millilitri contenente PBS meno meno e trasferirlo in una piastra di Petri sterile senza tritare. Per rimuovere la maggior parte del sangue residuo, somministrare due lavaggi di PBS meno al parenchima polmonare a cubetti o al segmento dell'arteria polmonare.
Quindi, posizionare i campioni in provette da 15 millilitri e incubare con cinque millilitri di collagenasi di tipo II per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per rimuovere i frammenti di grandi dimensioni, posizionare un colino sterile di un millimetro sulla parte superiore del tubo di raccolta da 50 millilitri e versare l'intero contenuto dal tubo da 15 millilitri sul colino. Quindi, massaggiare delicatamente il tessuto digerito con una spatola prima di risciacquare il campione con PBS meno fino a riempire il tubo di raccolta.
Per rimuovere le cellule endoteliali non vascolari, filtrare il deflusso raccolto dalle cellule digerite in un tubo fresco da 50 millilitri utilizzando un filtro cellulare di dimensioni a maglie di 70 micrometri. Quindi, utilizzando un filtro cellulare di dimensioni ridotte di 40 micrometri, raccogliere il deflusso in un tubo fresco da 50 millilitri etichettato come Tube 1. Centrifugare i campioni a 30 G per cinque minuti a temperatura ambiente per sedimentare i grappoli cellulari.
Utilizzare una pipetta sterile per trasferire il surnatante in un tubo fresco da 50 millilitri etichettato come tubo 2. Sospendi il pellet nel tubo 1 e riempi il tubo fino a 50 millilitri con PBS meno meno. Allo stesso modo, riempire Tube 2 fino a 50 millilitri con PBS meno meno.
Una volta fatto, centrifugare i campioni a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Sospendi i pellet con due millilitri di terreno di coltura e semina la sospensione in due pozzetti separati di una piastra a sei pozzetti precodificata. È stato osservato che parte degli aggregati cellulari trattati, comprese le cellule muscolari lisce o SMC e fibroblasti, erano legati a fibre lunghe.
Inoltre, le SMC rappresentavano la maggior parte dei singoletti non appartenenti alle cellule del sangue. Piccoli gruppi compatti di cellule con diametri non superiori a 10-20 micrometri erano privi di elementi attribuibili a frammenti di tessuto stromale. Sono state ottenute circa il 70% di cellule endoteliali microvascolari polmonari umane pure, o HLMVEC, singole cellule.
Pur ottenendo preparati HLMVEC puri, le cellule selezionate hanno assunto la caratteristica forma endoteliale. Al microscopio focale è emerso che quasi il 100% delle cellule purificate del grasso è risultato positivo per gli antigeni delle cellule endoteliali, vale a dire CD31 e il più specifico fattore di von Willebrand. Quando queste cellule erano sedute in matrigel, generavano strutture tubulari e HUVEC, confermando il loro fenotipo endoteliale.
A causa del breve tempo di incubazione durante la digestione enzimatica, è importante preriscaldare la collagenasi. E un altro punto è che durante la sedimentazione dei cluster cellulari, è importante rimuovere delicatamente il surnatante senza toccare gli aggregati cellulari nel pallet. Questa procedura si basa sull'uso della centrifugazione e delle filtrazioni, e quindi potrebbe fornire nuove intuizioni da sapere per separare altri tipi di cellule sulla base delle loro caratteristiche, come dimensioni e clustering.
