原代肝细胞是体外肝脏相关研究的重要工具。然而，这些细胞的扩增和维持历来具有挑战性，因为它们在培养几天后会失去形态和功能。3D 类器官是一种尖端工具，能够在培养皿中重现组织以进行长期培养，克服了在体外无法扩增至原代肝细胞的问题。
这项工作的总体目标是详尽、详细和重要的方案，描述大鼠肝脏灌注和原代肝细胞分离的关键步骤，以使研究人员能够加速和优化 3D 类器官培养，在 42 摄氏度下进行温水浴，然后将灌注缓冲液和 PBS 一对放入水浴中 20 分钟。将原代肝细胞完全培养基和 PBS，加入 3% pen-strepped 置于冰上。准备蠕动泵并将管道与玻璃瓶和气泡捕集器连接，两者都装满了灌注缓冲液。
用温热的灌注缓冲液填充管道，以去除气泡并洗涤残留的乙醇。通过腹膜内注射麻醉剂混合物麻醉成年大鼠。剃掉腹部并用 70% 乙醇清洁，以减少手术过程中的细菌污染。
将大鼠放在解剖盘的中间，并用针固定四肢。从下腹部中心到胸腔，穿过皮肤和肌肉做一个 U 形切口。夹住皮肤并折叠到头部，露出肠道。
小心地将肠道移至动物左侧，从腹腔中移出，露出肝门静脉和腔静脉。使用钳子，在门静脉下缝合，并准备两个结，一厘米，一个接一个，围绕静脉本身。将 100 至 150 单位溶解在 PBS 中的肝素注射到静脉覆盖物中，以防止血液凝固。
以低速打开泵。将 18 号血管导管插入门静脉，在相对于静脉成平角的线水平。取下内针，将套管留在静脉中。
使用鲁尔锁连接器连接到它的出口端。闭合结，并将管子稳定在正确的位置。然后切开腔静脉，让血液流出。
肝脏应该会在两到三秒内迅速开始肿胀和漂白。这证实了灌注缓冲液正在流经肝脏。以每分钟 10 毫升的速度缓慢增加泵速，并保持至少 10 分钟，以便从血液中清洁肝脏。
在灌注期间，用棉签对腔静脉施加压力，间隔 10 秒。肝脏在夹闭期间应肿胀，并在静脉释放时松弛，导致细胞解离增强。定期重复压力。
灌注后，将灌注溶液切换到预热的消化溶液，不要中断液流并避免管道中出现任何气泡。以每分钟 20 毫升的速度增加泵速，并定期继续用棉签按压以缓解肝脏肿胀和松弛。消化缓冲液后，肝脏应该看起来呈糊状。
此时，可以取出针头并停止泵。对于肝脏解剖，用镊子轻轻抓住叶之间的中央结缔组织。切断与其他器官的所有连接，并提升肝脏。
清洗肝脏，只需浸入预冷的 PBS 和 3% pen-strep 溶液中几秒钟。然后放入预冷的含 William 培养基试管中。在生物罩下，将肝脏转移到培养皿中，加入 15 毫升冷的 William 完全培养基，放在装满冰块的托盘上。
用刮刀剧烈扰动组织，以释放培养基中的细胞。如果肝脏消化正确执行，释放应该很容易。收集含有细胞的培养基，并在无菌 Falcon 管中转移时用过滤器过滤。
将约 15 毫升冷的 William's 完全培养基倒在培养皿中捣碎的肝脏上，以帮助释放更多细胞并重复过滤。在释放阶段结束时，释放肝细胞后，过滤介质应不透明。剩余的肝脏应该看起来是纤维状的，会被丢弃。
离心含有肝细胞的过滤培养基，低速断裂。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 40 毫升冰冷的 William 完全培养基中，然后重复离心。弃去上清液，然后将细胞调色板重悬于 25 毫升冰冷的 William 完全培养基中，将 25 毫升 90% Percoll 溶液加入试管中并轻轻混合。
您应该在试管底部获得一个可见的调色板，对应于活的肝细胞，以及梯度顶部由死亡肝细胞组成的层。从梯度顶部吸出死细胞层，留下 1 至 2 mL 的培养基和沉淀。将沉淀重悬于 30、40 mL 培养基中。
在 4 摄氏度下以 200 g 离心 10 分钟，然后吸出上清液。添加适量的培养基进行计数。用 1 至 10 台盼蓝计数细胞活力。
对于 2D 培养，将原代肝细胞以每孔 500， 000 个细胞的浓度接种在胶原蛋白包被的细胞板上，用预热的 William's 完全培养基接种在胶原蛋白包被的细胞板上，并置于培养箱中。三到四个小时后，将培养基更换为新的预热 William 完全培养基。对于 3D 肝细胞培养，将原代肝细胞悬浮在 20 μL Geltrex 中，浓度为 1， 000 个细胞的冷纯 Geltrex 基质中。
将板倒置并在培养箱中放置 20 至 30 分钟，以使基质固化。然后翻转平板，加入 3D 特异性培养基。每两到三天更换一次培养基。
代表性结果。在设置程序结束时，我们从约 300 克大鼠的肝脏中分离出 8 个细胞，每 10 个细胞的产量高达 1 个。78% 和 97% 之间的细胞活力已通过台盼蓝确定，在 Percoll 密度梯度后计数。
铺板后 4 小时，肝细胞呈长方体形态。第一天，原代肝细胞获得了典型的六边形，脂滴开始可见。第 2 天到第 3 天，脂滴增加，而在第 4 天到第 5 天，细胞积累肌动蛋白应激纤维。
在培养的最初几天，活力已经急剧下降，第一天达到 49.5%。第三天的低点为 33.5%，第五天达到 9.1%。在肝脏类器官铺板的第 0 天，我们测量的是 30 微米。
在培养的第二天，肝脏类器官的尺寸几乎增加了一倍，突显了在第 5 天也保持的尺寸增长。第一天的肝脏类器官形状是圆形，而第二天它们显示的是一串葡萄形状。第 15 天，即使 EdU 掺入率低，也存在肝细胞、绿色细胞的增殖活性，9%结论。
3D 类器官被认为是个性化医疗的前沿领域，并允许长期肝细胞培养。与 2D 肝细胞相比，肝脏类器官在第 15 天仍然存活并处于活跃增殖状态，显示出更长期的潜力。尖端 3D 技术的质量要求活肝细胞的良好产量以及良好的肝脏灌注和分离。
我们阐明了在原代大鼠肝细胞分离中可能看起来更关键的步骤，并总结了容易影响该技术在大鼠模型中成功的分散技巧。
