Giriş.Primer hepatositler in vitro karaciğer ile ilgili çalışmalar için önemli bir araçtır. Bununla birlikte, bu hücrelerin genişlemesi ve bakımı, kültürde birkaç gün sonra morfolojiyi ve işlevselliği kaybettikleri için tarihsel olarak zor olmuştur. 3D organoidler, in vitro olarak birincil hepatositlere genişleyememe sorununun üstesinden gelen, uzun süreli bir kültür için bir tabaktaki dokuları özetleyebilen son teknoloji bir araçtır.
Bu çalışmanın genel amacı, araştırmacıların 3D organoid kültürünü, 42 santigrat derecede ılık su banyosunu hızlandırmalarına ve optimize etmelerine ve ardından perfüzyon tamponu ve PBS'yi 20 dakika boyunca su banyosuna yerleştirmelerine izin vermek için sıçan karaciğer perfüzyonunun ve primer hepatosit izolasyonunun önemli adımlarını kapsamlı, ayrıntılı ve sonuç olarak ortaya çıkan bir protokolde tanımlamaktır. Birincil hepatositleri tam orta ve PBS'yi yerleştirin, buz üzerine% 3 kalemle streplenmiş olarak ekleyin. Peristaltik pompayı hazırlayın ve boruyu, her ikisi de perfüzyon tamponu ile doldurulmuş cam şişe ve kabarcık kapanı ile bağlayın.
Hava kabarcıklarını gidermek ve kalan etanolü yıkamak için tüpü ılık perfüzyon tamponu ile doldurun. Erişkin sıçan intraperitoneal anestezik karışım enjeksiyonu ile uyuşturuldu. Ameliyat sırasında bakteriyel kontaminasyonu azaltmak için karnı tıraş edin ve %70 etanol ile temizleyin.
Fareyi diseksiyon tepsisinin ortasına yerleştirin ve uzuvları iğneler kullanarak sabitleyin. Alt karnın merkezinden göğüs kafesine kadar deri ve kas boyunca U şeklinde bir kesi yapın. Cildi kelepçeleyin ve bağırsakları açığa çıkararak başa doğru katlayın.
Bağırsakları dikkatlice hayvanın sol tarafına, karın boşluğundan dışarı doğru hareket ettirin ve hepatik portal ven ve vena kava'yı açığa çıkarın. Pense kullanarak, portal venin altına bir dikiş atın ve damarın kendisini çevreleyen bir santimetre, biri diğerinden iki düğüm hazırlayın. Kan pıhtılaşmasını önlemek için PBS'de çözünmüş 100 ila 150 ünite heparini vena kapağına enjekte edin.
Pompayı düşük hız oranıyla açın. 18 gauge anjiyokatı portal damara, damara göre düz bir açıyla iplik seviyesinde yerleştirin. Kanülü damarda bırakmak için iç iğneyi çıkarın.
Bir luer kilit konektörü kullanarak çıkış ucuna bağlayın. Düğümü kapatın ve tüpü doğru konumda sabitleyin. Sonra kanın çıkmasına izin vermek için vena kava'yı kesin.
Karaciğer iki ila üç saniye içinde hızla şişmeye ve ağartmaya başlamalıdır. Bu, perfüzyon tamponunun karaciğerden aktığını doğrular. Pompa hızını dakikada 10 mililitre olarak yavaşça artırın ve karaciğerin kandan temizlenmesini sağlamak için en az 10 dakika koruyun.
Perfüzyon sırasında vena kavaya 10 saniye aralıklarla sürüntü ile baskı uygulayın. Karaciğer klemp sırasında şişmeli ve damar serbest bırakıldığında gevşemelidir, bu da hücre ayrışmasının artmasına neden olur. Basıncı periyodik olarak tekrarlayın.
Perfüzyondan sonra, akışı kesintiye uğratmadan ve tüpte herhangi bir hava kabarcığı oluşmasını önlemeden perfüzyon solüsyonunu önceden ısıtılmış sindirim solüsyonuna geçirin. Pompa hızını dakikada 20 mililitre artırın ve karaciğer şişmesi ve rahatlaması için periyodik olarak çubukla bastırmaya devam edin. Sindirim tamponundan sonra, karaciğer duygusal görünmelidir.
Bu noktada iğne çıkarılabilir ve pompa durdurulabilir. Karaciğer diseksiyonu için, forseps ile loblar arasındaki merkezi bağ dokusunu nazikçe tutun. Diğer organlarla olan tüm bağlantıyı kesin ve karaciğeri kaldırın.
Karaciğeri yıkayın, sadece önceden soğutulmuş PBS'ye ve birkaç saniye boyunca %3 kalem-strep solüsyonuna batırın. Ardından önceden soğutulmuş William'ın orta içeren tüpüne yerleştirin. Biyolojik başlık altında, karaciğeri 15 mililitre soğuk William'ın tam ortamıyla birlikte buz dolu bir tepsinin üzerine Petri kabına aktarın.
Ortamdaki hücreleri serbest bırakmak için dokuyu kazıyıcı ile kuvvetlice rahatsız edin. Karaciğer sindirimi doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, serbest bırakma kolay olmalıdır. Ortam içeren hücreleri toplayın ve steril bir Falcon tüpüne aktarırken filtre ile süzün.
Daha fazla hücrenin serbest kalmasına ve filtrasyonun tekrarlanmasına yardımcı olmak için yaklaşık 15 mililitre soğuk William'ın tam ortamını Petri kabındaki parçalanmış karaciğerin üzerine dökün. Serbest bırakma aşamasının sonunda, filtre ortamı hepatik hücreleri serbest bıraktıktan sonra opak olmalıdır. Kalan karaciğer lifli görünmeli ve atılmalıdır.
Düşük hızlı kırılma ile hepatik hücreler içeren filtrelenmiş ortamı santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 40 mililitre buz gibi William'ın tam ortamında yeniden süspanse edin, ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı atın ve ardından hücre paletini 25 mililitre buz gibi soğuk William'ın tam ortamında yeniden süspanse edin, tüpe 25 mililitre,% 90 Percoll çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Tüpün alt kısmında, canlı hepatositlere karşılık gelen görünür bir palet ve ölü hepatositler tarafından oluşturulan gradyanın üstündeki tabaka elde etmelisiniz. Ölü hücre tabakasını gradyanın üstünden aspire edin ve bir pelet ile bir, iki mililitre ortam bırakın. Peleti 30, 40 mililitre ortamda tekrar süspanse edin.
Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin. Sayma için uygun miktarda ortam ekleyin. Bir ila 10 tripan mavisi ile hücre canlılığını sayın.
2D kültür için, birincil hepatositler, önceden ısıtılmış William'ın tam ortamı ile kollajen kaplı hücre plakaları üzerinde altı çok kuyulu kuyu başına 500.000 hücre konsantrasyonunda kaplandı ve inkübatöre yerleştirildi. Üç ila dört saat sonra, ortam önceden ısıtılmış yeni William'ın tam ortamına değiştirildi. 3D hepatosit kültürü için, birincil hepatositler, 20 mikrolitre Geltrex'te 1.000 hücre konsantrasyonunda soğuk saf Geltrex matrisinde süspanse edildi.
Plaka ters çevrildi ve matris katılaşmasına izin vermek için 20 ila 30 dakika inkübatörde bırakıldı. Daha sonra plaka döndürüldü ve 3D'ye özgü kültür ortamı eklendi. Ortam her iki ila üç günde bir değiştirildi.
Temsili sonuçlar. Kurulum prosedürlerinin sonunda, yaklaşık 300 gram sıçanın karaciğerinden izolasyon başına sekiz hücreye 10'da bire kadar bir hücre verimi elde ettik. %78 ile %97 arasındaki hücre canlılığı, Percoll yoğunluk gradyanından sonra sayılarak tripan mavisi ile belirlenmiştir.
Kaplamadan dört saat sonra, hepatositler küboidal bir morfoloji gösterdi. Birinci gün, birincil hepatositler tipik altıgen şeklini aldı ve lipit damlacıkları görünür olmaya başladı. İki ila üçüncü günde, lipit damlacıkları artarken, dört ila beşinci günlerde hücreler aktin stres lifleri biriktirir.
Kültürün ilk günlerinde canlılıkta ciddi bir azalma meydana geldi ve ilk gün% 49.5'e ulaştı. Bu, üçüncü günde %33,5'e düşüyor ve beşinci günde %9,1'e ulaşıyor. Hepatik organoidlerin kaplanmasının sıfırıncı gününde, 30 mikrometre ölçüyoruz.
Kültürün ikinci gününde, hepatik organoidler boyutlarını neredeyse iki katına çıkardı ve beşinci günde de sürdürülen boyut büyümesinin altını çizdi. Birinci gün hepatik organoid şekli yuvarlak şekildeydi, ikinci gün ise üzüm salkımı şeklini gösterdiler. 15. günde, EdU katılımı düşük olsa bile, hepatositlerin, yeşil hücrelerin proliferatif bir aktivitesi mevcuttu,% 9Sonuç.
3D organoidler, kişiselleştirilmiş tıp için bir sınır olarak kabul edilir ve uzun süreli bir hepatosit kültürüne izin verir. 2D hepatositlerle karşılaştırıldığında, hepatik organoidler hala canlıydı ve 15. günde aktif proliferasyondaydı ve daha uzun vadeli bir potansiyel gösterdi. En son 3D tekniğinin kalitesi, iyi bir canlı hepatosit verimi ve iyi yapılmış bir karaciğer perfüzyonu ve izolasyonu gerektirir.
Primer sıçan hepatosit izolasyonunda daha kritik olarak görünebilecek adımları açıklığa kavuşturuyoruz ve sıçan modelinde tekniğin başarısını kolayca etkileyebilecek dağınık uçları özetliyoruz.
