Les hépatocytes primaires sont un outil important pour les études in vitro liées au foie. Cependant, l’expansion et le maintien de ces cellules ont toujours été difficiles car elles perdent leur morphologie et leur fonctionnalité après quelques jours de culture. Les organoïdes 3D sont un outil de pointe capable de récapituler les tissus d’une boîte pour une culture à long terme, surmontant ainsi le problème de l’incapacité à s’étendre aux hépatocytes primaires in vitro.
L’objectif global de ce travail est de décrire dans un protocole exhaustif, détaillé et conséquent, les étapes cruciales de la perfusion hépatique de rat et de l’isolement des hépatocytes primaires, afin de permettre aux chercheurs d’accélérer et d’optimiser la culture d’organoïdes 3D, un bain d’eau chaude à 42 degrés Celsius, puis de placer le tampon de perfusion et le PBS une paire dans le bain d’eau pendant 20 minutes. Placez le milieu complet des hépatocytes primaires et le PBS, ajoutés avec 3% de stylo streppé sur de la glace. Préparez la pompe péristaltique et connectez le tube à la bouteille en verre et au piège à bulles, tous deux remplis d’un tampon de perfusion.
Remplissez la tubulure avec un tampon de perfusion chaud afin d’éliminer les bulles d’air et de laver l’éthanol résiduel. Anesthésie du rat adulte par injection intrapéritonéale d’un mélange d’anesthésiques. Rasez l’abdomen et nettoyez-le avec de l’éthanol à 70 % pour réduire la contamination bactérienne pendant la chirurgie.
Placez le rat au milieu du plateau de dissection et fixez les membres à l’aide d’aiguilles. Faites une incision en forme de U à travers la peau et les muscles, du centre du bas-ventre jusqu’à la cage thoracique. Clamp la peau et repliée jusqu’à la tête, exposant les intestins.
Déplacez délicatement l’intestin vers le côté gauche de l’animal, hors de la cavité abdominale, et exposez la veine porte hépatique et la veine cave. À l’aide d’une pince, passez une suture sous la veine porte et préparez deux nœuds, d’un centimètre, l’un de l’autre, qui entourent la veine elle-même. Injectez 100 à 150 unités d’héparine dissoute dans le PBS dans le couvercle veineux pour prévenir la coagulation sanguine.
Allumez la pompe à faible vitesse. Insérez l’angiocath de calibre 18 dans la veine porte, au niveau du fil dans un angle plat par rapport à la veine. Retirez l’aiguille intérieure pour laisser la canule dans la veine.
Connectez-vous à l’extrémité de sortie de celui-ci à l’aide d’un connecteur Luer Lock. Fermez le nœud et stabilisez le tube dans la bonne position. Coupez ensuite la veine cave pour laisser sortir le sang.
Le foie devrait rapidement commencer à gonfler et à blanchir en deux à trois secondes. Cela confirme que le tampon de perfusion circule dans le foie. Augmentez lentement la vitesse de la pompe à 10 millilitres par minute et maintenez au moins 10 minutes pour permettre le nettoyage du foie du sang.
Pendant la perfusion, appliquez une pression avec un écouvillon sur la veine cave pendant 10 secondes d’intervalle. Le foie doit gonfler pendant la clamp et se détendre lors de la libération des veines, ce qui entraîne une meilleure dissociation cellulaire. Répétez la pression périodiquement.
Après la perfusion, passez la solution de perfusion à la solution de digestion pré-réchauffée sans interrompre le débit et en évitant toute bulle d’air dans la tubulure. Augmentez la vitesse de la pompe à 20 millilitres par minute et continuez périodiquement à appuyer avec un écouvillon pour l’enflure et la relaxation du foie. Après le tampon de digestion, le foie doit avoir l’air pâteux.
À ce stade, l’aiguille peut être retirée et la pompe arrêtée. Pour le curage ganglionnaire hépatique, saisissez doucement le tissu conjonctif central, entre les lobes avec une pince. Coupez toute la connexion avec d’autres organes et soulevez le foie.
Lavez le foie, en l’immergeant simplement dans le PBS pré-réfrigéré, plus une solution de streptocoque à 3 % pendant quelques secondes. Placez ensuite dans le tube contenant du milieu William’s pré-refroidi. Sous capot biologique, transférez le foie dans la boîte de Pétri avec 15 millilitres de milieu complet William’s froid, sur un plateau rempli de glace.
Perturbez vigoureusement les tissus avec le grattoir pour libérer les cellules dans le milieu. Si la digestion du foie est correctement exécutée, la libération devrait être facile. Prélevez le milieu contenant les cellules et filtrez-le avec le filtre tout en transférant dans un tube Falcon stérile.
Versez environ 15 millilitres de milieu complet William froid sur le foie écrasé dans la boîte de Pétri pour aider à libérer plus de cellules et répétez la filtration. À la fin de la phase de libération, le média filtrant doit s’opaquer après la libération des cellules hépatiques. Le foie restant devrait avoir l’air fibreux et serait jeté.
Centrifuger le milieu filtré contenant des cellules hépatiques à rupture à basse vitesse. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 40 millilitres de milieu complet glacé William’s, puis répétez la centrifugation. Jetez le surnageant, puis remettez en suspension la palette cellulaire dans 25 millilitres de milieu complet glacé William’s, ajoutez 25 millilitres de solution Percoll à 90 % dans le tube et mélangez délicatement.
Vous devriez obtenir une palette visible sur le bas du tube correspondant aux hépatocytes viables, et la couche sur le dessus du gradient composée d’hépatocytes morts. Aspirez la couche de cellules mortes par le haut du gradient et laissez un, deux millilitres de milieu avec une pastille. Remettre le granulé en suspension dans 30, 40 millilitres de fluide.
Centrifuger à 200g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirer le surnageant. Ajoutez une quantité appropriée de milieu pour le comptage. Comptez la viabilité cellulaire avec un à 10 trypan bleu.
Pour la culture 2D, les hépatocytes primaires ont été placés à une concentration de 500 000 cellules par puits de six multipuits sur des plaques cellulaires recouvertes de collagène avec un milieu complet de William préchauffé, puis placés dans l’incubateur. Après trois à quatre heures, le milieu a été remplacé par un nouveau milieu complet de William préchauffé. Pour la culture d’hépatocytes 3D, les hépatocytes primaires ont été mis en suspension dans une matrice Geltrex pure à froid à la concentration de 1 000 cellules dans 20 microlitres de Geltrex.
La plaque a été retournée et laissée dans l’incubateur pendant 20 à 30 minutes pour permettre la solidification de la matrice. Ensuite, la plaque a été retournée et un milieu de culture spécifique à la 3D a été ajouté. Le support a été changé tous les deux à trois jours.
Des résultats représentatifs. À la fin des procédures de mise en place, nous avons obtenu un rendement cellulaire allant jusqu’à une pour 10 à huit cellules par isolement du foie d’environ 300 grammes de rat. La viabilité cellulaire entre 78 % et 97 % a été établie par le bleu trypan, en comptant après le gradient de densité de Percoll.
Quatre heures après le placage, les hépatocytes présentaient une morphologie cuboïdale. Le premier jour, les hépatocytes primaires ont acquis leur forme hexagonale typique et les gouttelettes lipidiques commencent à être visibles. Le deuxième ou le troisième jour, les gouttelettes lipidiques augmentent, tandis que le quatrième au cinquième jour, les cellules accumulent des fibres de stress d’actine.
Une réduction drastique de la viabilité s’est produite dès les premiers jours de la culture, atteignant 49,5 % le premier jour. Ce niveau est au plus bas à 33,5 % le troisième jour et atteint 9,1 % le cinquième jour. Au jour zéro du placage d’organoïdes hépatiques, nous mesurons 30 micromètres.
Le deuxième jour de la culture, les organoïdes hépatiques ont presque doublé leurs dimensions, soulignant la croissance de la taille qui se maintient également au cinquième jour. La forme de l’organoïde hépatique le premier jour était de forme ronde, tandis qu’ils montraient la forme de la grappe de raisin le deuxième jour. Au jour 15, une activité proliférative des hépatocytes, des cellules vertes, était présente même si l’incorporation d’EdU était faible, 9%Conclusion.
Les organoïdes 3D sont considérés comme une frontière pour la médecine personnalisée, et permettent une culture d’hépatocytes à long terme. Par rapport aux hépatocytes 2D, les organoïdes hépatiques étaient encore viables et en prolifération active au 15e jour, démontrant un potentiel à plus long terme. La qualité de la technique 3D de pointe nécessite un bon rendement en hépatocytes viables et une perfusion et un isolement hépatiques bien réalisés.
Nous clarifions les étapes qui pourraient sembler plus critiques dans l’isolement des hépatocytes primaires du rat, et résumons les conseils épars qui peuvent facilement affecter le succès de la technique dans le modèle de rat.
