מבוא.הפטוציטים ראשוניים הם כלי חשוב למחקרים הקשורים לכבד חוץ גופי. עם זאת, ההתרחבות והתחזוקה של תאים אלה היו מאתגרות מבחינה היסטורית מכיוון שהם מאבדים מורפולוגיה ופונקציונליות לאחר מספר ימים בתרבית. אורגנואידים תלת ממדיים הם כלי חדשני המסוגל לשחזר רקמות בצלחת לתרבות ארוכת טווח, להתגבר על הבעיה של חוסר היכולת להתרחב להפטוציטים הראשוניים במבחנה.
המטרה הכוללת של העבודה הנוכחית היא לתאר בפרוטוקול מקיף, מפורט ותוצאתי, את השלבים המכריעים של זילוח כבד חולדה, ובידוד הפטוציטים הראשוני, על מנת לאפשר לחוקרים להאיץ ולייעל את תרבית האורגנואידים התלת-ממדית, אמבט מים חמים ב -42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להציב חיץ זילוח וזוג אחד PBS באמבט המים למשך 20 דקות. מניחים את הפטוציטים הראשוניים כבינוניים שלמים ו-PBS, בתוספת 3% עט על קרח. הכינו את המשאבה הפריסטלטית וחברו את הצינור לבקבוק הזכוכית ולמלכודת הבועות, שניהם מלאים בחיץ זילוח.
מלאו את הצינורית בחיץ זילוח חם על מנת להסיר בועות אוויר ולשטוף שאריות אתנול. מרדים את החולדה הבוגרת על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת הרדמה. יש לגלח את הבטן ולנקות אותה עם אתנול 70% כדי להפחית זיהום חיידקי במהלך הניתוח.
הניחו את החולדה במרכז מגש הדיסקציה ואבטחו את הגפיים באמצעות מחטים. בצע חתך בצורת U דרך העור והשריר, ממרכז הבטן התחתונה, לכלוב הצלעות. מהדקים את העור ומקופלים עד הראש, חושפים את המעיים.
בזהירות להעביר את המעי לצד שמאל של החיה, מתוך חלל הבטן, ולחשוף את וריד פורטל הכבד ואת vena cava. בעזרת צבת, להפעיל תפר מתחת לווריד הפורטל ולהכין שני קשרים, סנטימטר אחד, אחד מהשני, המקיפים את הווריד עצמו. הזריקו 100 עד 150 יחידות של הפרין מומס ב-PBS לתוך כיסוי הווריד כדי למנוע קרישת דם.
הפעל את המשאבה במהירות נמוכה. הכנס את האנגיוקאת 18 מד לווריד הפורטלי, ברמת החוט בזווית שטוחה ביחס לווריד. הסר את המחט הפנימית כדי להשאיר את הצינורית בווריד.
התחבר לקצה השקע שלו באמצעות מחבר luer lock. סגור את הקשר, וייצב את הצינור במיקום הנכון. ואז לחתוך את נבוב הווריד כדי לתת לדם לצאת.
הכבד אמור להתחיל להתנפח ולהלבין במהירות תוך שתיים עד שלוש שניות. זה מאשר שחיץ זילוח זורם דרך הכבד. לאט להגדיל את מהירות המשאבה ב 10 מיליליטר לדקה, ולשמור לפחות 10 דקות כדי לאפשר את ניקוי הכבד מהדם.
במהלך הזלוף, להחיל לחץ עם ספוגית על נבוב הווריד במשך 10 שניות מרווחים. הכבד אמור להתנפח במהלך המהדק, ולהירגע עם שחרור הוורידים, מה שמוביל לדיסוציאציה מוגברת של תאים. חזור על הלחץ מעת לעת.
לאחר הזילוח, החליפו את תמיסת הזילוח לתמיסת העיכול המחוממת מראש מבלי להפריע לזרימה ולהימנע מבועת אוויר בצינורית. הגדל את מהירות המשאבה ב -20 מיליליטר לדקה, ומעת לעת המשך ללחוץ עם מטוש לנפיחות בכבד והרפיה. לאחר חיץ העיכול, הכבד צריך להיראות עבש.
בשלב זה ניתן להסיר את המחט ולעצור את המשאבה. לדיסקציה של הכבד, לתפוס בעדינות את רקמת החיבור המרכזית, בין האונות עם מלקחיים. חותכים את כל החיבור לאיברים אחרים, ומרימים את הכבד.
שטפו את הכבד, פשוט טבלו ב-PBS המצונן מראש, בתוספת תמיסת 3%pen-strep למשך מספר שניות. לאחר מכן מניחים בצינור המכיל את המדיום של ויליאם המצונן מראש. מתחת למכסה המנוע הביולוגי, מעבירים את הכבד לצלחת פטרי עם 15 מיליליטר קר בתווך המלא של ויליאם, על מגש מלא קרח.
להפריע את הרקמה במרץ עם מגרד לשחרר את התאים בתווך. אם העיכול בכבד מבוצע כראוי, השחרור צריך להיות קל. אספו את התאים המכילים את התווך וסננו אותו עם הפילטר תוך כדי העברה בצינור פלקון סטרילי.
יוצקים כ-15 מיליליטר של התווך המלא של ויליאם הקר, על הכבד המרוסק בצלוחית הפטרי כדי לעזור לשחרר תאים נוספים ולחזור על הסינון. בסוף שלב השחרור, מדיום המסנן צריך להיות אטום לאחר שחרור תאי הכבד. הכבד הנותר צריך להיראות סיבי ויושלך לפח.
צנטריפוגה המדיום המסונן המכיל תאי כבד עם הפסקה במהירות נמוכה. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את כדורית התא ב-40 מיליליטר קר כקרח בתווך המלא של ויליאם, ואז חזרו על הצנטריפוגה. יש להשליך את הסופרנטנט, ולאחר מכן להשהות מחדש את לוח התאים ב-25 מיליליטר קר כקרח בתווך המלא של ויליאם, להוסיף 25 מיליליטר, 90% תמיסת פרקול לצינור ולערבב בעדינות.
אתה צריך לקבל לוח גלוי על החלק התחתון של הצינור המתאים hepatocytes קיימא, ואת השכבה על החלק העליון של שיפוע מורכב על ידי hepatocytes מתים. שואפים את שכבת התא המת מראש השיפוע ומשאירים אחד, שני מיליליטר של מדיום עם כדור. להשעות את הגלולה ב 30, 40 מיליליטר של בינוני.
צנטריפוגה במשקל 200 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז שואפים לסופר-נטנט. הוסף כמות מתאימה של מדיום לספירה. ספור את יכולת הקיום של התא עם אחד עד 10 טריפאן כחול.
עבור תרבית דו-ממדית, הפטוציטים הראשוניים צופו בריכוז של 500, 000 תאים לבאר של שש בארות מרובות על לוחות תאים מצופים קולגן עם התווך המלא של ויליאם שחומם מראש, והונחו באינקובטור. לאחר שלוש עד ארבע שעות, המדיום הוחלף בתווך חדש שחומם מראש של ויליאם. עבור תרבית הפטוציטים 3D, hepatocytes ראשוניים היו תלויים במטריצת Geltrex טהורה קרה בריכוז של 1, 000 תאים ב 20 מיקרוליטר של Geltrex.
הצלחת התהפכה והושארה באינקובטור למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר התמצקות מטריצה. לאחר מכן הועלתה הצלחת, ונוסף מדיום תרבות ספציפי לתלת מימד. המדיום הוחלף כל יומיים-שלושה.
תוצאות מייצגות. בתום הליכי ההקמה, השגנו תפוקת תאים של עד אחד ל-10 לשמונת התאים בכל בידוד מהכבד של כ-300 גרם חולדה. יכולת הקיום של התא בין 78% ל-97% נקבעה על ידי כחול טריפאן, ספירה לאחר שיפוע צפיפות פרקול.
ארבע שעות לאחר הציפוי, הפטוציטים הראו מורפולוגיה קובואידית. ביום הראשון, הפטוציטים הראשוניים רכשו את צורתם המשושה האופיינית, וטיפות שומנים מתחילות להיות גלויות. ביום השני עד השלישי טיפות השומנים גדלות, ואילו ביום הרביעי עד החמישי התאים צוברים סיבי עקה של אקטין (actin stress fibers).
ירידה דרסטית בכדאיות התרחשה כבר בימים הראשונים של התרבות והגיעה ל-49.5% ביום הראשון. זה שפל של 33.5% ביום השלישי, ומגיע ל-9.1% ביום החמישי. ביום אפס של ציפוי אורגנואידים בכבד, אנחנו מודדים 30 מיקרומטר.
ביום השני של התרבית, אורגנואידים בכבד כמעט הכפילו את ממדיהם, מה שמדגיש את צמיחת הגודל שנשמרת גם ביום החמישי. צורת אורגנואיד הכבד ביום הראשון הייתה עגולה, בעוד שהם הראו את צורת צרור הענבים ביום השני. ביום ה-15, פעילות שגשוג של הפטוציטים, תאים ירוקים, הייתה נוכחת גם אם שילוב ה-EdU היה נמוך, 9%.
אורגנואידים תלת ממדיים נחשבים לחזית הרפואה המותאמת אישית, ומאפשרים תרבית הפטוציטים לטווח ארוך. בהשוואה להפטוציטים דו-ממדיים, אורגנואידים בכבד היו עדיין בני קיימא ובהתפשטות פעילה ביום ה-15, מה שמדגים פוטנציאל לטווח ארוך יותר. האיכות של טכניקה תלת ממדית חדשנית, דורשת תשואה טובה של hepatocytes קיימא זילוח כבד מבוצע היטב ובידוד.
אנו מבהירים שלבים שיכולים להיראות קריטיים יותר בבידוד הפטוציטים הראשוני של חולדות, ומסכמים את הקצוות המפוזרים שיכולים להשפיע בקלות על הצלחת הטכניקה במודל החולדות.
