Einleitung.Primäre Hepatozyten sind ein wichtiges Werkzeug für in vitro Leberstudien. Die Expansion und Erhaltung dieser Zellen war jedoch in der Vergangenheit eine Herausforderung, da sie nach einigen Tagen in Kultur an Morphologie und Funktionalität verlieren. 3D-Organoide sind ein hochmodernes Werkzeug, das in der Lage ist, Gewebe in einer Schale für eine Langzeitkultur zu rekapitulieren und so das Problem der Unfähigkeit zu überwinden, sich in vitro auf die primären Hepatozyten auszudehnen.
Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, in einem vollständigen, detaillierten und konsequenten Protokoll die entscheidenden Schritte der Leberperfusion von Ratten und der Isolierung primärer Hepatozyten zu beschreiben, um es den Forschern zu ermöglichen, die 3D-Organoidkultur zu beschleunigen und zu optimieren, ein warmes Wasserbad bei 42 Grad Celsius und dann Perfusionspuffer und PBS ein Paar für 20 Minuten in das Wasserbad zu legen. Platzieren Sie die primären Hepatozyten vollständig medium und PBS, zugegeben mit 3%pen-gestepped auf Eis. Bereiten Sie die Peristaltikpumpe vor und verbinden Sie den Schlauch mit der Glasflasche und der Blasenfalle, die beide mit Perfusionspuffer gefüllt sind.
Füllen Sie den Schlauch mit warmem Perfusionspuffer, um Luftblasen zu entfernen und Ethanolreste zu waschen. Betäubung der erwachsenen Ratte durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung. Rasieren Sie den Bauch und reinigen Sie ihn mit 70% Ethanol, um die bakterielle Kontamination während der Operation zu reduzieren.
Legen Sie die Ratte in die Mitte des Seziertabletts und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Nadeln. Machen Sie einen U-förmigen Schnitt durch die Haut und den Muskel, von der Mitte des Unterbauchs, bis zum Brustkorb. Klemmen Sie die Haut fest und falten Sie sie zum Kopf hoch, so dass der Darm freigelegt wird.
Bewegen Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite des Tieres, aus der Bauchhöhle, und legen Sie die Leberpfortader und die Hohlvene frei. Führen Sie mit einer Zange eine Naht unter die Pfortader und bereiten Sie zwei Knoten vor, einen Zentimeter voneinander entfernt, die die Vene selbst umgeben. Injizieren Sie 100 bis 150 Einheiten in PBS gelöstes Heparin in die Venenhülle, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
Schalten Sie die Pumpe mit einer niedrigen Drehzahl ein. Führen Sie den 18-Gauge-Angiokath in die Pfortader ein, und zwar auf Höhe des Fadens in einem flachen Winkel relativ zur Vene. Entfernen Sie die innere Nadel, um die Kanüle in der Vene zu belassen.
Verbinden Sie es mit einem Luer-Lock-Anschluss mit dem Auslassende. Schließen Sie den Knoten und stabilisieren Sie den Schlauch in der richtigen Position. Schneiden Sie dann die Hohlvene auf, damit das Blut austreten kann.
Die Leber sollte in zwei bis drei Sekunden schnell anfangen zu schwellen und zu bleichen. Dies bestätigt, dass der Perfusionspuffer durch die Leber fließt. Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl langsam auf 10 Milliliter pro Minute und halten Sie sie mindestens 10 Minuten ein, damit die Leber vom Blut gereinigt werden kann.
Während der Perfusion üben Sie im Abstand von 10 Sekunden mit einem Tupfer Druck auf die Hohlvene aus. Die Leber sollte während der Klemmung anschwellen und sich bei der Venenfreisetzung entspannen, was zu einer verstärkten Zelldissoziation führt. Wiederholen Sie den Druck regelmäßig.
Schalten Sie nach der Perfusion die Perfusionslösung auf die vorgewärmte Aufschlusslösung um, ohne den Fluss zu unterbrechen und Luftblasen im Schlauch zu vermeiden. Erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 20 Milliliter pro Minute und drücken Sie regelmäßig weiter mit einem Tupfer, um die Leber zu anschwellen und zu entspannen. Nach dem Verdauungspuffer sollte die Leber matschig aussehen.
An dieser Stelle kann die Nadel entfernt und die Pumpe gestoppt werden. Für die Leberdissektion greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach dem zentralen Bindegewebe zwischen den Lappen. Durchtrenne alle Verbindungen zu anderen Organen und hebe die Leber an.
Waschen Sie die Leber und tauchen Sie sie einige Sekunden lang in das vorgekühlte PBS plus 3%ige Streptokokkenlösung. Dann in die vorgekühlte Tube von William's Medium geben. Unter biologischer Haube die Leber mit 15 Millilitern kaltem Williams vollständigem Medium über ein Tablett voller Eis in die Petrischale geben.
Stören Sie das Gewebe kräftig mit dem Schaber, um die Zellen im Medium freizusetzen. Wenn die Leberverdauung korrekt durchgeführt wird, sollte die Freisetzung leicht sein. Sammeln Sie das Medium, das Zellen enthält, und filtrieren Sie es mit dem Filter, während Sie es in ein steriles Falcon-Röhrchen umfüllen.
Gießen Sie etwa 15 Milliliter kaltes William's Complete Medium über die zerdrückte Leber in der Petrischale, um mehr Zellen freizusetzen und die Filtration zu wiederholen. Am Ende der Freisetzungsphase sollte das Filtermedium nach der Befreiung der Leberzellen undurchsichtig sein. Die verbleibende Leber sollte faserig aussehen und würde verworfen werden.
Das filtrierte Medium, das Leberzellen enthält, wird mit einer Pause mit geringer Drehzahl zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 40 Millilitern eiskaltem Williams vollständigem Medium, dann wiederholen Sie die Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die Zellpalette in 25 Milliliter eiskaltem Williams vollständigem Medium. Geben Sie 25 Milliliter, 90%ige Percoll-Lösung in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig.
Sie sollten eine sichtbare Palette auf dem Boden des Röhrchens erhalten, die den lebensfähigen Hepatozyten entspricht, und die Schicht auf der Oberseite des Gradienten, die aus toten Hepatozyten besteht. Aspirieren Sie die abgestorbene Zellschicht von der Spitze des Gradienten und lassen Sie ein, zwei Milliliter Medium mit einem Pellet belassen. Resuspendieren Sie das Pellet in 30, 40 Millilitern Medium.
Bei 200 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, dann Überstand absaugen. Fügen Sie eine angemessene Menge Medium für die Zählung hinzu. Zählen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem bis 10 Trypanblau.
Für die 2D-Kultur wurden primäre Hepatozyten in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Vertiefung von sechs Multi-Wells auf kollagenbeschichteten Zellplatten mit vorgewärmtem Williams vollständigem Medium plattiert und in den Inkubator gegeben. Nach drei bis vier Stunden wurde das Medium auf neues vorgewärmtes Williams komplettes Medium umgestellt. Für die 3D-Hepatozytenkultur wurden primäre Hepatozyten in einer kalten reinen Geltrex-Matrix in einer Konzentration von 1.000 Zellen in 20 Mikrolitern Geltrex suspendiert.
Die Platte wurde auf den Kopf gestellt und 20 bis 30 Minuten im Inkubator belassen, um die Verfestigung der Matrix zu ermöglichen. Dann wurde die Platte umgedreht und 3D-spezifisches Kulturmedium hinzugefügt. Das Medium wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt.
Repräsentative Ergebnisse. Am Ende der Setup-Verfahren erhielten wir eine Zellausbeute von bis zu einer pro 10 bis acht Zellen pro Isolation aus der Leber von etwa 300 Gramm Ratte. Die Zellviabilität zwischen 78 % und 97 % wurde durch Trypanblau ermittelt, wobei nach dem Percoll-Dichtegradienten gezählt wird.
Vier Stunden nach der Beschichtung zeigten die Hepatozyten eine quaderförmige Morphologie. Am ersten Tag nahmen die primären Hepatozyten ihre typische sechseckige Form an, und Lipidtröpfchen begannen sichtbar zu werden. Am zweiten bis dritten Tag nehmen die Lipidtröpfchen zu, während die Zellen an den Tagen vier bis fünf Aktin-Stressfasern ansammeln.
Bereits in den ersten Tagen der Kultur kam es zu einer drastischen Verringerung der Lebensfähigkeit auf 49,5 % am ersten Tag. Dieser Tiefstand liegt am dritten Tag bei 33,5 % und erreicht am fünften Tag 9,1 %. Am Tag Null der Beschichtung von Leberorganoiden messen wir 30 Mikrometer.
Am zweiten Tag der Kultivierung verdoppelten die Leberorganoide ihre Größe nahezu, was das Größenwachstum unterstreicht, das auch am fünften Tag anhält. Die Form der Leberorganoide am ersten Tag war rund, während sie am zweiten Tag die Form der Trauben zeigten. An Tag 15 war eine proliferative Aktivität von Hepatozyten, grünen Blutkörperchen, vorhanden, auch wenn der EdU-Einbau gering war, 9%Fazit.
3D-Organoide gelten als Wegweiser für die personalisierte Medizin und ermöglichen eine langfristige Hepatozytenkultur. Im Vergleich zu 2D-Hepatozyten waren Leberorganoide am Tag 15 noch lebensfähig und in aktiver Proliferation, was ein längerfristiges Potenzial zeigt. Die Qualität der hochmodernen 3D-Technik erfordert eine gute Ausbeute an lebensfähigen Hepatozyten und eine gut durchgeführte Leberperfusion und -isolierung.
Wir klären Schritte, die bei der Isolierung primärer Hepatozyten von Ratten als kritischer erscheinen könnten, und fassen die verstreuten Tipps zusammen, die den Erfolg der Technik im Rattenmodell leicht beeinflussen können.
