Introdução.Os hepatócitos primários são uma importante ferramenta para estudos hepáticos in vitro. No entanto, a expansão e manutenção dessas células têm sido historicamente desafiadoras, pois perdem morfologia e funcionalidade após alguns dias em cultura. Os organoides 3D são uma ferramenta de ponta capaz de recapitular tecidos em um prato para uma cultura de longo prazo, superando o problema da incapacidade de expandir para os hepatócitos primários in vitro.
O objetivo geral do presente trabalho é descrever em um protocolo exaustivo, detalhado e conseqüente, as etapas cruciais da perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos, a fim de permitir que os pesquisadores acelerem e otimizem a cultura organoide 3D, banho-maria morna a 42 graus Celsius e, em seguida, coloquem tampão de perfusão e PBS um par no banho-maria por 20 minutos. Coloque os hepatócitos primários em meio completo e PBS, adicionados com 3% de caneta em gelo. Prepare a bomba peristáltica e conecte a tubulação com a garrafa de vidro e a armadilha de bolhas, ambas preenchidas com tampão de perfusão.
Encha o tubo com tampão de perfusão quente para remover bolhas de ar e lavar o etanol residual. Anestesiou o rato adulto por injeção intraperitoneal de mistura anestésica. Raspe o abdômen e limpe-o com etanol 70% para reduzir a contaminação bacteriana durante a cirurgia.
Coloque o rato no meio da bandeja de dissecção e prenda os membros usando agulhas. Faça uma incisão em forma de U através da pele e do músculo, do centro da parte inferior do abdômen até a caixa torácica. Prenda a pele e dobre até a cabeça, expondo os intestinos.
Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do animal, para fora da cavidade abdominal, e exponha a veia porta hepática e a veia cava. Usando um alicate, faça uma sutura sob a veia porta e prepare dois nós, um centímetro, um do outro, que circundam a própria veia. Injete 100 a 150 unidades de heparina dissolvida em PBS na tampa da veia para evitar a coagulação do sangue.
Ligue a bomba com uma taxa de velocidade baixa. Insira o angiocateter de calibre 18 na veia porta, ao nível da rosca em um ângulo plano em relação à veia. Remova a agulha interna para deixar a cânula na veia.
Conecte-se à extremidade de saída usando um conector luer lock. Feche o nó e estabilize o tubo na posição correta. Em seguida, corte a veia cava para deixar o sangue sair.
O fígado deve começar a inchar e clarear rapidamente em dois a três segundos. Isso confirma que o tampão de perfusão está fluindo pelo fígado. Aumente lentamente a velocidade da bomba a 10 mililitros por minuto e mantenha pelo menos 10 minutos para permitir a limpeza do fígado do sangue.
Durante a perfusão, aplique pressão com swab na veia cava por intervalos de 10 segundos. O fígado deve inchar durante o clampeamento e relaxar após a liberação da veia, levando a uma maior dissociação celular. Repita a pressão periodicamente.
Após a perfusão, troque a solução de perfusão para a solução de digestão pré-aquecida sem interromper o fluxo e evitando qualquer bolha de ar na tubulação. Aumente a velocidade da bomba em 20 mililitros por minuto e continue periodicamente a pressionar com cotonete para inchaço e relaxamento do fígado. Após o tampão de digestão, o fígado deve parecer mole.
Neste ponto, a agulha pode ser removida e a bomba parada. Para a dissecção do fígado, agarre suavemente o tecido conjuntivo central, entre os lobos com uma pinça. Corte toda a conexão com outros órgãos e levante o fígado.
Lave o fígado, apenas mergulhando no PBS pré-resfriado, mais solução de 3% de pen-strep por alguns segundos. Em seguida, coloque no tubo contendo meio de William pré-resfriado. Sob o capuz biológico, transfira o fígado para a placa de Petri com 15 mililitros de meio completo de William frio, sobre uma bandeja cheia de gelo.
Agite o tecido vigorosamente com o raspador para liberar as células no meio. Se a digestão do fígado for executada corretamente, a liberação deve ser fácil. Colete o meio contendo células e filtre-o com o filtro enquanto transfere em um tubo Falcon estéril.
Despeje cerca de 15 mililitros do meio completo de William frio, sobre o fígado esmagado na placa de Petri para ajudar a liberar mais células e repetir a filtração. No final da fase de liberação, o meio filtrante deve ficar opaco após a liberação das células hepáticas. O fígado restante deve parecer fibroso e seria descartado.
Centrifugar o meio filtrado contendo células hepáticas com ruptura de baixa velocidade. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 40 mililitros de meio completo de William gelado, depois repetir a centrifugação. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda a paleta de células em 25 mililitros de meio completo de William gelado, adicione 25 mililitros, solução de 90% de Percoll no tubo e misture suavemente.
Você deve obter uma paleta visível na parte inferior do tubo correspondente aos hepatócitos viáveis e a camada na parte superior do gradiente composta por hepatócitos mortos. Aspire a camada de células mortas do topo do gradiente e deixe um, dois mililitros de meio com um pellet. Ressuspenda o pellet em 30, 40 mililitros de meio.
Centrifugue a 200g por 10 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, aspire o sobrenadante. Adicione uma quantidade apropriada de meio para a contagem. Conte a viabilidade celular com um a 10 azul de tripano.
Para a cultura 2D, os hepatócitos primários foram plaqueados a uma concentração de 500.000 células por poço de seis poços múltiplos em placas celulares revestidas de colágeno com meio completo de William pré-aquecido e colocados na incubadora. Após três a quatro horas, o meio foi alterado para o novo meio completo pré-aquecido de William. Para a cultura de hepatócitos 3D, os hepatócitos primários foram suspensos em matriz Geltrex pura fria na concentração de 1.000 células em 20 microlitros de Geltrex.
A placa foi virada de cabeça para baixo e deixada na incubadora por 20 a 30 minutos para permitir a solidificação da matriz. Em seguida, a placa foi virada para cima e o meio de cultura específico para 3D foi adicionado. O meio foi trocado a cada dois ou três dias.
Resultados representativos. Ao final dos procedimentos de montagem, obtivemos um rendimento celular de até uma por 10 para as oito células por isolamento do fígado de cerca de 300 gramas de rato. A viabilidade celular entre 78% e 97% foi estabelecida pelo azul de tripano, contando após o gradiente de densidade de Percoll.
Às quatro horas após o plaqueamento, os hepatócitos apresentaram morfologia cuboidal. No primeiro dia, os hepatócitos primários adquiriram sua forma hexagonal típica e as gotículas lipídicas começam a ser visíveis. No segundo a terceiro dia, as gotículas lipídicas aumentam, enquanto no quarto a quinto dia, as células acumulam fibras de estresse de actina.
Uma redução drástica da viabilidade ocorreu já nos primeiros dias de cultivo, chegando a 49,5% no primeiro dia. Isso diminui em 33,5% no terceiro dia e chega a 9,1% no quinto dia. No dia zero de revestimento de organoides hepáticos, estamos medindo 30 micrômetros.
No segundo dia de cultura, os organoides hepáticos quase dobraram suas dimensões, destacando o crescimento do tamanho que é mantido também no quinto dia. A forma organoide hepática no primeiro dia era redonda, enquanto eles mostravam a forma de cacho de uva no segundo dia. No dia 15, uma atividade proliferativa de hepatócitos, células verdes, estava presente mesmo que a incorporação de EdU fosse baixa, 9%Conclusão.
Os organoides 3D são considerados uma fronteira para a medicina personalizada e permitem uma cultura de hepatócitos a longo prazo. Em comparação com os hepatócitos 2D, os organoides hepáticos ainda eram viáveis e em proliferação ativa no dia 15, demonstrando um potencial de longo prazo. A qualidade da técnica 3D de ponta requer um bom rendimento de hepatócitos viáveis e uma perfusão e isolamento hepático bem executados.
Esclarecemos as etapas que podem parecer mais críticas no isolamento primário de hepatócitos de rato e resumimos as pontas dispersas que podem facilmente afetar o sucesso da técnica no modelo de rato.
