はじめに初代肝細胞は、in vitro肝臓関連研究のための重要なツールです。しかし、これらの細胞の増殖と維持は、数日培養すると形態と機能が失われるため、歴史的に困難でした。3Dオルガノイドは、ディッシュ内の組織を長期間培養し、in vitroで初代肝細胞に増殖できないという問題を克服できる最先端のツールです。
本研究の全体的な目標は、研究者が3Dオルガノイド培養をスピードアップし、最適化できるように、ラット肝灌流の重要なステップと初代肝細胞の単離を網羅的で詳細かつ結果的なプロトコルで説明することです。これにより、研究者は摂氏42度の温水浴を行い、その後、灌流バッファーとPBSを1対の水浴に20分間配置できます。初代肝細胞を完全な培地とPBSに入れ、氷上に3%ペンで加えます。蠕動ポンプを準備し、チューブをガラス瓶とバブルトラップ(両方とも灌流バッファーで満たされた)に接続します。
チューブに温かい灌流バッファーを充填して、気泡を取り除き、残留エタノールを洗浄します。成体ラットに麻酔薬ミックスの腹腔内注射により麻酔をかけた。腹部を剃り、70%エタノールで洗浄することで、手術中の細菌汚染を減らします。
ラットを解剖トレイの中央に置き、針で手足を固定します。下腹部の中心から胸郭まで、皮膚と筋肉をU字型に切開します。皮膚を固定し、頭まで折りたたんで腸を露出させます。
腸を動物の左側に慎重に移動させ、腹腔から出し、肝門脈と大静脈を露出させます。ペンチを使用して、門脈の下に縫合糸を通し、静脈自体を囲む2つの結び目、1センチメートル、もう1センチメートルの準備をします。PBSに溶解したヘパリン100〜150単位を大静脈カバーに注入して、血液凝固を防ぎます。
低速でポンプをオンにします。18ゲージの血管カテーテルを門脈に挿入し、糸のレベルで静脈に対して平らな角度で挿入します。内側の針を取り外して、カニューレを静脈に残します。
ルアーロックコネクタを使用して、その出口端に接続します。結び目を閉じ、チューブを正しい位置に安定させます。次に、大静脈を切って血液を排出します。
肝臓はすぐに腫れ始め、2〜3秒で漂白を開始するはずです。これにより、灌流バッファーが肝臓を流れていることが確認されます。ポンプ速度を毎分10ミリリットルでゆっくりと上げ、血液から肝臓を洗浄できるように少なくとも10分間維持します。
灌流中に、綿棒で大静脈に10秒間隔で圧力をかけます。肝臓はクランプ中に腫れ、静脈が解放されると弛緩し、細胞の解離が促進されます。定期的に圧力を繰り返します。
灌流後、流れを中断したりチューブ内の気泡を避けたりすることなく、灌流溶液を予熱した消化溶液に切り替えます。ポンプ速度を毎分20ミリリットルに上げ、定期的に綿棒で押し続けて肝臓の腫れとリラクゼーションを図ります。消化バッファーの後、肝臓はどろどろに見えるはずです。
この時点で、針を取り外してポンプを停止できます。肝臓の解剖では、鉗子で葉の間の中央結合組織をそっとつかみます。他の臓器へのすべての接続を切断し、肝臓を持ち上げます。
肝臓を洗い、あらかじめ冷やしたPBSに加えて3%連鎖球菌溶液に数秒間浸します。次に、事前に冷やしたウィリアムの培地入りチューブに入れます。生物学的フードの下で、氷でいっぱいのトレイの上に、15ミリリットルの冷たいウィリアムの完全な培地で肝臓をペトリ皿に移します。
スクレーパーで組織を激しく攪乱し、培地中の細胞を放出します。肝臓の消化が正しく行われていれば、放出は容易であるべきです。細胞を含む培地を回収し、滅菌済みのFalconチューブに移しながらフィルターでろ過します。
ペトリ皿の砕けた肝臓に約15ミリリットルの冷たいウィリアムの完全な培地を注ぎ、より多くの細胞を放出し、ろ過を繰り返すのを助けます。放出フェーズの終わりに、肝細胞を解放した後、フィルター媒体は不透明になるはずです。残りの肝臓は繊維状に見えるはずで、廃棄されます。
肝細胞を含むろ過された培地を低速で遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを40ミリリットルの氷冷したウィリアムズ完全培地に再懸濁し、遠心分離を繰り返します。上清を捨ててから、セルパレットを25ミリリットルの氷冷したウィリアムの完全な培地に再懸濁し、25ミリリットル、90%Percoll溶液をチューブに加え、穏やかに混合します。
生存可能な肝細胞に対応するチューブの底に見えるパレットを取得し、死んだ肝細胞によって構成されたグラデーションの上部にレイヤーを取得する必要があります。グラジエントの上から死細胞層を吸引し、ペレットを含む1〜2ミリリットルの培地を残します。ペレットを30、40ミリリットルの媒体に再懸濁します。
200gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を吸引します。カウントに適切な量の培地を追加します。1〜10個のトリパンブルーで細胞生存率をカウントします。
2D培養のために、初代肝細胞を、予め加温したウィリアムズ完全培地を用いてコラーゲン被覆細胞プレート上に6つのマルチウェルのウェル当たり500, 000細胞の濃度でプレーティングし、インキュベーターに入れた。3〜4時間後、培地は新しい予温済みウィリアムの完全な培地に変更されました。3D肝細胞培養では、初代肝細胞を冷たく純粋なGeltrexマトリックスに20マイクロリットルのGeltrex中に1, 000個の細胞の濃度で懸濁した。
プレートを逆さまにしてインキュベーターに20〜30分間放置し、マトリックスの固化を可能にしました。次に、プレートを上にして、3D特異的な培地を追加しました。媒体は2〜3日ごとに交換されました。
代表的な結果。セットアップ手順の終了時に、我々は、約300グラムのラットの肝臓からの単離につき10個から8個の細胞に対して最大1個の細胞収量を得た。78%から97%の間の細胞生存率は、Percoll密度勾配の後にカウントして、トリパンブルーによって確立されています。
めっき後4時間で、肝細胞は立方体の形態を示しました。初日から、初代肝細胞は典型的な六角形を獲得し、脂肪滴が見え始めます。2日目から3日目には脂肪滴が増加し、4日目から5日目にはアクチンストレス繊維が蓄積します。
生存率の劇的な低下は、培養の最初の数日間ですでに発生しており、初日には49.5%に達しました。3日目には33.5%と最低、5日目には9.1%に達します。肝臓オルガノイドのめっきゼロ日目には、30マイクロメートルを測定しています。
培養2日目には、肝臓オルガノイドの寸法がほぼ2倍になり、5日目にも維持されるサイズの成長が強調されました。1日目の肝臓オルガノイドの形状は丸い形でしたが、2日目はブドウの房の形を示しました。15日目には、EdUの取り込みが低かった場合でも、肝細胞である緑色細胞の増殖活性が見られました(9%)結論。
3Dオルガノイドは、個別化医療のフロンティアと考えられており、長期的な肝細胞培養を可能にします。2D肝細胞と比較して、肝臓オルガノイドは15日目にまだ生存可能であり、活発な増殖を示しており、より長期的な可能性を示しています。最先端の3D技術の品質には、生存可能な肝細胞の良好な収率と、適切に実施された肝臓灌流および分離が必要です。
初代ラット肝細胞単離においてより重要と思われるステップを明確にし、ラットモデルにおける技術の成功に容易に影響を与える可能性のある散在するヒントをまとめる。
