소개원발성 간세포는 체외 간 관련 연구를 위한 중요한 도구입니다. 그러나 이러한 세포의 확장 및 유지는 배양 후 며칠 후에 형태와 기능을 잃기 때문에 역사적으로 어려웠습니다. 3D 오가노이드는 장기 배양을 위해 접시의 조직을 재추출할 수 있는 최첨단 도구로, in vitro에서 1차 간세포로 확장할 수 없는 문제를 극복합니다.
본 연구의 전반적인 목표는 연구자들이 3D 오가노이드 배양을 가속화하고 최적화하기 위해 쥐의 간 관류 및 원발성 간세포 분리의 중요한 단계를 철저하고 상세하며 결과적인 프로토콜로 설명하는 것입니다. 섭씨 42도의 온수 수조에서 관류 완충액과 PBS 한 쌍을 수조에 20분 동안 넣습니다. 원발성 간세포를 완전한 배지와 PBS에 놓고 얼음에 3%의 펜을 추가합니다. 연동 펌프를 준비하고 튜브를 관류 완충액으로 채워진 유리병 및 버블 트랩에 연결합니다.
기포를 제거하고 잔류 에탄올을 세척하기 위해 튜브를 따뜻한 관류 완충액으로 채웁니다. 마취제 혼합물의 복강내 주사로 성인 쥐를 마취시켰다. 복부를 면도하고 70% 에탄올로 세척하여 수술 중 세균 오염을 줄이십시오.
쥐를 해부 트레이 중앙에 놓고 바늘을 사용하여 팔다리를 고정합니다. 하복부 중앙에서 흉곽까지 피부와 근육을 통해 U자형으로 절개합니다. 피부를 조이고 머리까지 접어 내장을 드러냅니다.
장을 동물의 왼쪽으로 조심스럽게 이동하여 복강 밖으로 빼내고 간문맥과 대정맥을 노출시킵니다. 펜치를 사용하여 문맥 아래에 봉합사를 실행하고 정맥 자체를 둘러싸고 있는 두 개의 매듭(1cm, 다른 매듭)을 준비합니다. PBS에 용해된 100-150 단위의 헤파린을 대정맥 커버에 주입하여 혈액 응고를 방지합니다.
저속으로 펌프를 켭니다. 18게이지 혈관 주사를 정맥에 대해 평평한 각도로 실 높이에서 문맥에 삽입합니다. 캐뉼라를 정맥에 남겨 두기 위해 내부 바늘을 제거하십시오.
루어 잠금 커넥터를 사용하여 출구 끝에 연결하십시오. 매듭을 닫고 튜브를 올바른 위치에 고정합니다. 그런 다음 대정맥을 잘라 피가 빠져나가도록 합니다.
간은 2-3초 안에 빠르게 부풀어 오르고 표백되기 시작해야 합니다. 이는 관류 완충액이 간을 통해 흐르고 있음을 확인합니다. 펌프 속도를 분당 10밀리리터로 천천히 높이고 혈액에서 간을 청소할 수 있도록 최소 10분을 유지합니다.
관류 중에는 면봉으로 대정맥에 10초 간격으로 압력을 가합니다. 간은 고정하는 동안 부풀어 오르고 정맥이 방출되면 이완되어 세포 해리가 향상되어야 합니다. 주기적으로 압력을 반복하십시오.
관류 후에는 흐름을 중단하지 않고 튜브에 기포가 생기지 않도록 관류 용액을 예열된 소화 용액으로 전환하십시오. 펌프 속도를 분당 20밀리리터로 높이고 주기적으로 면봉으로 계속 눌러 간 부종과 이완을 촉진합니다. 소화 완충 후 간은 흐물흐물해 보여야 합니다.
이 시점에서 바늘을 제거하고 펌프를 멈출 수 있습니다. 간 박리의 경우 겸자로 엽 사이의 중앙 결합 조직을 부드럽게 잡습니다. 다른 장기와의 모든 연결을 끊고 간을 들어 올립니다.
간을 세척하고 사전 냉각된 PBS에 몇 초 동안 3%pen-strep 용액을 담그십시오. 그런 다음 미리 냉각된 William의 매체 함유 튜브에 넣습니다. 생물학적 후드 아래에서 간을 얼음이 가득 찬 트레이 위에 15ml의 차가운 William's Complete medium과 함께 페트리 접시에 옮깁니다.
스크레이퍼로 조직을 세게 저어 배지의 세포를 방출합니다. 간 소화가 올바르게 이루어지면 방출이 쉬워야 합니다. 세포가 포함된 배지를 수집하고 멸균 Falcon 튜브에서 이식하는 동안 필터로 여과합니다.
페트리 접시의 으깬 간 위에 약 15ml의 차가운 William's Complete medium을 부어 더 많은 세포를 방출하고 여과를 반복합니다. 방출 단계가 끝나면 필터 매체는 간 세포를 방출한 후 불투명해야 합니다. 남아 있는 간은 섬유질로 보여야 하며 버려집니다.
간세포를 포함하는 여과된 매체를 저속 브레이크로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 40ml의 얼음처럼 차가운 William의 완전한 매체에 재현탁시킨 다음 원심분리를 반복합니다. 상층액을 버리고 25 밀리리터의 얼음처럼 차가운 윌리엄의 완전한 매체에 셀 팔레트를 재현탁시키고 25 밀리리터, 90 % 퍼콜 용액을 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다.
생존 가능한 간세포에 해당하는 튜브 하단에 눈에 보이는 팔레트를 얻어야 하고, 죽은 간세포로 구성된 구배 상단의 층을 얻어야 합니다. 그래디언트의 상단에서 죽은 세포층을 흡인하고 펠릿과 함께 1, 2 밀리리터의 매체를 남겨 둡니다. 펠릿을 30, 40 밀리리터의 매체에 재현탁시킵니다.
200g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡입합니다. 계산을 위해 적절한 양의 매체를 추가하십시오. 1에서 10 trypan blue로 세포 생존율을 계산합니다.
제 2 배양을 위해, 1 차 간세포는 500, 사전 따뜻해진 윌리엄의 완전한 배지를 가진 콜라겐 코팅 세포 플레이트에 6 개의 멀티 웰 당 000 세포의 농도로 도금되고, 인큐베이터에 배치되었습니다. 3-4시간 후, 배지는 미리 데워진 새로운 William의 완전한 배지로 교체되었습니다. 3D 간세포 배양을 위해, 1 차 간세포는 1, Geltrex의 20 마이크로리터에 있는 000개의 세포의 농도에 차가운 순수한 Geltrex 매트릭스에 현탁되었다.
플레이트를 거꾸로 뒤집어 인큐베이터에서 20-30분 동안 방치하여 매트릭스 응고를 가능하게 했습니다. 그런 다음 플레이트를 올리고 3D 전용 배양 배지를 추가했습니다. 매체는 2-3일마다 교체했습니다.
대표적인 결과. 설정 절차의 끝에서, 우리는 약 300 그램의 쥐의 간에서 분리 당 8 개의 세포에 대해 10 당 1 개까지의 세포 수율을 얻었습니다. 78%와 97% 사이의 세포 생존율은 Percoll 밀도 구배 후에 계산되는 trypan blue에 의해 확립되었습니다.
도금 후 4시간이 지났을 때, 간세포는 직육면체 형태를 보였다. 첫째 날, 원발성 간세포는 전형적인 육각형 모양을 갖게 되었고 지질 방울이 보이기 시작했습니다. 2일에서 3일째에는 지질 방울이 증가하고 4일에서 5일째에는 세포에 액틴 스트레스 섬유가 축적됩니다.
생존력의 급격한 감소는 배양 첫날에 이미 발생하여 첫날에 49.5%에 도달했습니다. 셋째 날에는 33.5%로 최저치를 기록했고, 5일째에는 9.1%에 달했습니다. 간 오가노이드를 도금한 지 0일째에는 30마이크로미터를 측정하고 있습니다.
배양 2일째에는 간 오가노이드의 크기가 거의 두 배로 증가하여 5일째에도 유지되는 크기 성장을 강조합니다. 첫째 날에는 간 오가노이드 모양이 둥글었고, 둘째 날에는 포도 송이 모양을 보여주었습니다. 15일째에는 EdU 혼입이 낮더라도 녹색 세포인 간세포의 증식 활동이 9%로 나타났습니다.
3D 오가노이드는 개인 맞춤형 의학의 최전선으로 간주되며 장기적인 간세포 배양을 가능하게 합니다. 2D 간세포와 비교했을 때, 간 오가노이드는 15일째에도 여전히 생존 가능하고 활발하게 증식하고 있어 장기적인 잠재력을 보여주었습니다. 최첨단 3D 기술의 품질은 생존 가능한 간세포의 양호한 수율과 우수한 간 관류 및 격리를 필요로 합니다.
원발성 쥐 간세포 분리에서 더 중요할 수 있는 단계를 명확히 하고, 쥐 모델에서 기술의 성공에 쉽게 영향을 미칠 수 있는 흩어져 있는 팁을 요약합니다.
