Gli epatociti primari sono uno strumento importante per gli studi in vitro correlati al fegato. Tuttavia, l'espansione e il mantenimento di queste cellule sono state storicamente impegnative in quanto perdono morfologia e funzionalità dopo pochi giorni di coltura. Gli organoidi 3D sono uno strumento all'avanguardia in grado di ricapitolare i tessuti in una piastra per una coltura a lungo termine, superando il problema dell'incapacità di espandersi agli epatociti primari in vitro.
L'obiettivo generale del presente lavoro è quello di descrivere in un protocollo esaustivo, dettagliato e consequenziale, le fasi cruciali della perfusione epatica di ratto e l'isolamento degli epatociti primari, al fine di consentire ai ricercatori di accelerare e ottimizzare la coltura 3D di organoidi, bagno di acqua calda a 42 gradi Celsius, e quindi posizionare il tampone di perfusione e PBS una coppia nel bagno d'acqua per 20 minuti. Posizionare gli epatociti primari con terreno completo e PBS, addizionato con il 3% di penna-strepped su ghiaccio. Preparare la pompa peristaltica e collegare il tubo con il flacone di vetro e la trappola per bolle, entrambi riempiti con tampone di perfusione.
Riempire il tubo con un tampone di perfusione caldo per rimuovere le bolle d'aria e lavare l'etanolo residuo. Anestetizzato il ratto adulto mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di anestetico. Radere l'addome e pulirlo con etanolo al 70% per ridurre la contaminazione batterica durante l'intervento.
Posiziona il ratto al centro del vassoio di dissezione e fissa gli arti con gli aghi. Fai un'incisione a forma di U attraverso la pelle e il muscolo, dal centro del basso addome fino alla gabbia toracica. Clampe la pelle e piegata fino alla testa, esponendo l'intestino.
Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro dell'animale, fuori dalla cavità addominale, ed esporre la vena porta epatica e la vena cava. Con l'aiuto di una pinza, eseguire una sutura sotto la vena porta e preparare due nodi, uno di un centimetro, uno dall'altro, che circondano la vena stessa. Iniettare da 100 a 150 unità di eparina disciolta in PBS nel coperchio della vena per prevenire la coagulazione del sangue.
Accendere la pompa a bassa velocità. Inserire l'Angiocath calibro 18 nella vena porta, a livello del filo con un angolo piatto rispetto alla vena. Rimuovere l'ago interno per lasciare la cannula nella vena.
Collegare all'estremità di uscita utilizzando un connettore luer lock. Chiudere il nodo e stabilizzare il tubo nella giusta posizione. Quindi tagliare la vena cava per far uscire il sangue.
Il fegato dovrebbe iniziare rapidamente a gonfiarsi e sbiancarsi in due o tre secondi. Ciò conferma che il tampone di perfusione scorre attraverso il fegato. Aumentare lentamente la velocità della pompa a 10 millilitri al minuto e mantenerla per almeno 10 minuti per consentire la pulizia del fegato dal sangue.
Durante la perfusione, applicare pressione con tampone sulla vena cava per intervalli di 10 secondi. Il fegato dovrebbe gonfiarsi durante la presa e rilassarsi dopo il rilascio della vena, portando a una maggiore dissociazione cellulare. Ripetere periodicamente la pressione.
Dopo la perfusione, passare la soluzione di perfusione alla soluzione di digestione preriscaldata senza interrompere il flusso ed evitando bolle d'aria nel tubo. Aumentare la velocità della pompa a 20 millilitri al minuto e continuare periodicamente a premere con un tampone per gonfiore e rilassamento del fegato. Dopo il tampone della digestione, il fegato dovrebbe apparire pastoso.
A questo punto, l'ago può essere rimosso e la pompa fermata. Per la dissezione epatica, afferrare delicatamente il tessuto connettivo centrale, tra i lobi con una pinza. Taglia tutte le connessioni con altri organi e solleva il fegato.
Lavare il fegato, immergendolo semplicemente nel PBS pre-raffreddato, più il 3% di soluzione di penna-streptococco per alcuni secondi. Quindi mettere nel tubo contenente il mezzo William's pre-raffreddato. Sotto la cappa biologica, trasferire il fegato nella capsula di Petri con 15 millilitri di terreno completo freddo di William, su una teglia piena di ghiaccio.
Disturbare energicamente il tessuto con il raschietto per rilasciare le cellule nel terreno. Se la digestione del fegato viene eseguita correttamente, il rilascio dovrebbe essere facile. Raccogliere il terreno contenente le cellule e filtrarlo con il filtro durante il trasferimento in una provetta Falcon sterile.
Versare circa 15 millilitri di terreno freddo di William's complete, sul fegato schiacciato nella capsula di Petri per aiutare a rilasciare più cellule e ripetere la filtrazione. Al termine della fase di rilascio, il mezzo filtrante dovrebbe opacizzarsi dopo aver liberato le cellule epatiche. Il fegato rimanente dovrebbe apparire fibroso e verrebbe scartato.
Centrifugare il terreno filtrato contenente cellule epatiche con rottura a bassa velocità. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 40 millilitri di terreno completo di William ghiacciato, quindi ripetere la centrifugazione. Scartare il surnatante, quindi risospendere la tavolozza cellulare in 25 millilitri di terreno completo ghiacciato di William, aggiungere 25 millilitri, soluzione di Percoll al 90% nel tubo e mescolare delicatamente.
Si dovrebbe ottenere una tavolozza visibile sul fondo del tubo corrispondente agli epatociti vitali e lo strato sulla parte superiore del gradiente composto da epatociti morti. Aspirare lo strato di cellule morte dalla parte superiore del gradiente e lasciare uno, due millilitri di terreno con un pellet. Risospendere il pellet in 30, 40 millilitri di terreno.
Centrifugare a 200 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare il surnatante. Aggiungere una quantità appropriata di terreno per il conteggio. Contare la vitalità cellulare con un numero di blu di tripano compreso tra uno e 10.
Per la coltura 2D, gli epatociti primari sono stati piastrati a una concentrazione di 500.000 cellule per pozzetto di sei pozzetti multipli su piastre cellulari rivestite di collagene con il terreno completo di William preriscaldato e posti nell'incubatore. Dopo tre o quattro ore, il mezzo è stato cambiato con il nuovo mezzo completo di William preriscaldato. Per la coltura 3D degli epatociti, gli epatociti primari sono stati sospesi nella matrice fredda pura di Geltrex alla concentrazione di 1.000 cellule in 20 microlitri di Geltrex.
La piastra è stata capovolta e lasciata nell'incubatore per 20-30 minuti per consentire la solidificazione della matrice. Quindi la piastra è stata alzata ed è stato aggiunto un terreno di coltura specifico per il 3D. Il mezzo veniva cambiato ogni due o tre giorni.
Risultati rappresentativi. Al termine delle procedure di messa a punto, abbiamo ottenuto una resa cellulare fino a una su 10 per le otto cellule per isolamento dal fegato di circa 300 grammi di ratto. La vitalità cellulare tra il 78% e il 97% è stata stabilita dal blu di tripano, contando secondo il gradiente di densità di Percoll.
A quattro ore dalla placcatura, gli epatociti mostravano una morfologia cuboidale. Il primo giorno, gli epatociti primari hanno acquisito la loro tipica forma esagonale e le goccioline lipidiche iniziano ad essere visibili. Il secondo o il terzo giorno, le goccioline lipidiche aumentano, mentre dal quarto al quinto giorno le cellule accumulano fibre di actina stress.
Una drastica riduzione della vitalità si è verificata già nei primi giorni di coltura, raggiungendo il 49,5% il primo giorno. Questo minimo è del 33,5% il terzo giorno e raggiunge il 9,1% il quinto giorno. Il giorno zero della placcatura degli organoidi epatici, misuriamo 30 micrometri.
Nel secondo giorno di coltura, gli organoidi epatici hanno quasi raddoppiato le loro dimensioni, sottolineando la crescita dimensionale che si mantiene anche al quinto giorno. La forma dell'organoide epatico il primo giorno era rotonda, mentre il secondo giorno mostravano la forma del grappolo d'uva. Il giorno 15, era presente un'attività proliferativa degli epatociti, le cellule verdi, anche se l'incorporazione di EdU era bassa, 9%Conclusione.
Gli organoidi 3D sono considerati una frontiera per la medicina personalizzata e consentono una coltura di epatociti a lungo termine. Rispetto agli epatociti 2D, gli organoidi epatici erano ancora vitali e in proliferazione attiva al giorno 15, dimostrando un potenziale a lungo termine. La qualità della tecnica 3D all'avanguardia, richiede una buona resa di epatociti vitali e una perfusione e isolamento epatico ben eseguiti.
Chiariamo i passaggi che potrebbero apparire più critici nell'isolamento primario degli epatociti di ratto e riassumiamo le punte sparse che possono facilmente influenzare il successo della tecnica nel modello di ratto.
