Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren

Zusammenfassung

Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) enthalten oft mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen aktivieren, um allergische Entzündungen zu regulieren. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Identifizierung von dsRNA-Arten in HDM-Allergenen und die Charakterisierung ihrer immunogenen Aktivitäten bei der Modulation eosinophiler Lungenentzündungen.

Zusammenfassung

Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) sind oft in komplexen Formen, die sowohl allergische Proteine enthalten, die aberrante Typ-2-Antworten antreiben, als auch mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen auslösen. Diese allergenassoziierten mikrobiellen Komponenten spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung von Typ-2-Entzündlichen Erkrankungen wie allergischem Asthma. Die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben jedoch weitgehend undefiniert. Das hier vorgestellte Protokoll bestimmt die strukturellen Eigenschaften und die In-vivo-Aktivität allergenassoziierter immunostimulatorischer RNA. Insbesondere werden häufige Allergene auf das Vorhandensein von doppelsträngigen RNA-Arten (dsRNA) untersucht, die IFN-Reaktionen in der Lunge stimulieren und die Entwicklung schwerer Lungeneosinophilie in einem Mausmodell von HDM-induziertem allergischem Asthma hemmen können. Hier haben wir die folgenden drei Assays aufgenommen: Dot blot, um die dsRNA-Strukturen in der gesamten RNA zu zeigen, die von Allergenen einschließlich HDM-Arten isoliert sind, RT-qPCR zur Messung der Aktivitäten von HDM-RNA in interferonstimulierender Gene (ISGs) Expression in der Mauslunge und FACS-Analyse zur Bestimmung der Auswirkungen von HDM-RNA auf die Anzahl der Eosinophile in BAL bzw. Lunge.

Einleitung

Basierend auf der ursprünglich von Strachan¹vorgeschlagenen Hygienehypothese kann die frühkindliche Exposition gegenüber mikrobiellen Umweltfaktoren wie Endotoxin vor der Entwicklung allergischer Erkrankungen schützen^2,3. Bei mikrobiellen Infektionen, z.B. Virusinfektionen, löst der angeborene Immundetektion von Fremdnukleinsäuren (RNA/DNA) Wirtsabwehrreaktionen^4,5,6aus. Die Existenz und Prävalenz immunogener Nukleinsäuren wie lange doppelsträngige RNA-Arten (dsRNA) in Hausstaubmilben (HDM) oder anderen Insektenallergenen bleibt jedoch unbekannt. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um festzustellen, ob HDM oder Insekten- und Nicht-Insektenallergene lange dsRNA-Arten enthalten, die eine schützende Immunantwort aktivieren können, um der Entwicklung einer schweren eosinophilen Lungenentzündung in einem Mausmodell von allergischem Asthma entgegenzuwirken. Hier bieten wir drei einfache und schnelle Methoden zur Bewertung der strukturellen Determinanten in HDM-Gesamt-RNA, die zur Regulierung allergeninduzierter eosinophiler Lungenentzündungen erforderlich sind.

Das Mukosal-Immunsystem ist das größte Immunorgan im Körper und dient als erste Linie der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen und allergische Beleidigungen^7,8. Die lange dsRNA, das Replikationszwischenprodukt vieler Viren, ist dafür bekannt, als pathogenassoziiertes molekulares Muster (PAMP) zu fungieren, um angeborene Reaktionen über Toll wie Rezeptor 3 (TLR3) wirksam zu stimulieren, um die Expression von Interferon-stimulierten Genen (ISGs)^{9,10,11,12,13,14}zu induzieren. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass HDM-Gesamt-RNA dsRNA-Strukturen enthielt, die die Expression von ISGs hochregulierten und eine schwere eosinophile Lungenentzündung reduzierten, wenn sie über die intratracheale Instillation in einem murinen Modell von allergischem Asthma verabreicht wurde, das durch HDM-Extrakte induziert wurde¹⁵. Die Schwere der Lungenentzündungen wird durch die Analyse der Immunzelltypen in bronchoalveolarer Spülung (BAL) und Lungengewebe mittels Durchflusszytometrie^{16,17,18,19,20}bestimmt.

Dieses Protokoll enthält drei Assays: 1) schnelles Detektion von dsRNA-Strukturen mit RNA-Punktfleck mit einem mausmonoklonalen Antikörper J2, der speziell sequenzunabhängig an die dsRNA bindet; 2) schnelle Auswertung der In-vivo-Effekte immunostimulierender RNA in der Mauslunge durch Messung der Induktion von ISGs mit RT-qPCR; 3) genaue Quantifizierung von Eosinophilen in BAL und Lunge im Kontext von HDM-induzierten Lungenentzündungen mittels Flow-Zytometrie-Analyse.

Die oben genannten Assays können verwendet werden, um nicht nur allergische Lungenerkrankungen zu untersuchen, sondern auch respiratorische bakterielle und virale Infektionen. Beispielsweise kann der dsRNA-spezifische J2-Antikörper auch in anderen Anwendungen wie Immunaffinitätschromatographie, Immunhistochemie, enzymgebundenem Immunsorbent-Assay (ELISA) und Immunostaining^21,22,23eingesetzt werden. Darüber hinaus können mehrere Anwendungen nach der BAL-Flüssigkeitssammlung zur Quantifizierung löslicher Inhalte wie Zytokine und Chemokine mit ELISA und Transkriptionsprofilierung von Zellen in den Atemwegen (z. B. Alveolarmakrophagen) genutzt werden. Obwohl es eine Vielzahl von Protokollen in der Literatur zur Bewertung von Lungenerkrankungen gibt, konzentrieren sich die meisten dieser Protokolle häufig auf die Zielvalidierung. Die hier beschriebenen Verfahren können angewendet werden, um Komponenten in Umweltallergenen zu identifizieren, die für die Regulierung der Entwicklung allergischer Krankheiten wichtig sind.

Protokoll

Die hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Health San Antonio genehmigt.

1. Dot Blot, um das Vorhandensein von dsRNA-Strukturen in HDM-Gesamt-RNA zu zeigen

1. Vollständige RNA-Isolierung von Allergenen, Insekten und Nichtinsektenallergenen
   1. HDM,-Insekten oder Nicht-Insektentiere, die lebend gesammelt oder kommerziell gewonnen wurden, in 50 ml-Rohre geben und schnell mit Flüssig-N₂einfrieren. Dann bei -70 °C für die nachfolgende vollständige RNA-Isolierung lagern.
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden HDM-, Insekten- und Nichtinsektentiere ausgewählt, da sie als häufige Allergenquellen bekannt sind. Darüber hinaus bleibt eine immunstimulierende Funktion ihrer RNAs unklar.
   2. Übertragen Sie eine angemessene Menge (entspricht 100 l im Volumen oder weniger) von HDM-, Insekten- oder Nichtinsektentieren, die bei -70 °C gelagert werden,₂ in ein 2 ml-Rohr mit Perlen (1,4 mm Keramikkugeln), dann Gefrierrohre in einem Flüssigkeits-N2-Behälter für 10 min.
   3. Für die gesamte RNA-Isolierung 1 ml Guanidinium-Thiocyanat-basiertes RNA-Isolationsreagenz²⁴ in jede Röhre geben, dann das Insekt und nicht-insektierte Kleintiere mit einem hochenergetischen Zellstörer mit der maximalen Geschwindigkeit von 45 s brechen und auf Eis chillen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   4. Übertragen Sie die Lösung von Schritt 1.1.3 in ein neues 1,5 ml-Rohr und fügen Sie jedem Rohr und Wirbel 200 l Chloroform hinzu. Zentrifugenrohre bei 14.000 x g für 14 min bei 4 °C.
   5. Nach Abschluss der Zentrifugation die obere wässrige Phase (200 l) in ein neues 1,5 ml-Rohr mit 500 l Isopropanol übertragen, um das RNA-Pellet auszustoßen. Stören Sie die Interphase nicht. Das empfohlene Volumenverhältnis der oberen Phase im Vergleich zu Isopropanol beträgt 1:2,5 Verhältnis.
   6. Mischen Sie durch sanftes Wirbeln, dann Zentrifugenrohre bei 14.000 x g für 14 min bei 4 °C.
   7. Den Überstand mit Vorsicht ansaugen und dann das RNA-Pellet mit 500 l 75% Ethanol und Zentrifuge bei 7.500 x g 10 min bei 4 °C waschen. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten mit Vorsicht, trocknen Sie das Pellet lufttrocken und lösen Sie das RNA-Pellet mit 20-50 l RNase-frei_H2O auf.
   8. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer anhand der folgenden Parameter:
      1. Öffnen Sie die zugehörige Software und wählen Sie die Art der zu messenden Nukleinsäuren aus. Ändern Sie den Probentyp in RNA.
      2. Führen Sie die Leermessung mit 1-2 l RNase-frei H₂O durch. Wischen Sie die RNase-freie H₂O ab. Jetzt ist das Gerät für die Messung bereit.
      3. Laden Sie 1-2 l der RNA-Probe und messen Sie die RNA-Konzentration (g/l).
         ANMERKUNG: Das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 nm (A260/280) bei 2,0 (1,9-2,2) wird allgemein als "rein" für RNA akzeptiert. Wenn sie nicht sofort verarbeitet werden, speichern Sie RNA-Proben bei -70 °C und vermeiden Sie die Gefrier-Tau-Zyklen, um die RNA intakt zu halten.
2. Nachweis der dsRNA-Struktur in der gesamten RNA mit dsRNA-spezifischem J2-Antikörper
   1. Bereiten Sie zwei 20 L RNA-Proben (200 ng/L) vor. Eine mit RNase-III-Behandlung (1 l für 1 g RNA, Inkubation bei 37 °C für 60 min) und die andere ohne RNase-III-Behandlung.
      HINWEIS: RNase III wird hier verwendet, um dsRNA gezielt zu degradieren, aber nicht einsträngige RNA²⁵.
   2. Verwenden Sie einen Bleistift, um Gitter zu zeichnen, in denen RNA-Proben auf der Membran ausgelöscht werden.
   3. Spot 2 l der 200 ng/l der RNA-Probe auf die positiv geladene Nylonmembran.
   4. Vernetzen Sie die Proben mit der Membran bei 1.200 Mikrojoule x 100 in einem UV-Vernetzen. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 und 1.2.4 zwei weitere Male am Beispielpunkt. Dies führt zu einer Gesamtmenge von 0,8 g pro Blot.
      ANMERKUNG: Stellen Sie nicht mehr als 2 l RNA-Probe auf der Membran zu einem Zeitpunkt.
   5. Unspezifische Bindung mit 5% Milch in TBS-T für 1 h mit Schütteln bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie die Blockierlösung aus Schritt 1.2.5 und fügen Sie den Anti-dsRNA J2-Antikörper bei der Verdünnung von 1:1.000 in 1% Milch in TBS-T hinzu und inkubieren Sie ihn über Nacht mit Schütteln bei 4 °C.
   6. Waschen Sie die Membran mit TBS-T für 5 min und wiederholen Sie diesen Schritt für 3 Mal. Fügen Sie den sekundären Antikörper (Alkaline phosphatase-konjugierte Anti-Maus IgG in 1% Milch 1:5.000) und inkubieren für 1 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran mit TBS-T für 5 min und wiederholen Sie diesen Schritt für 3x.
   7. Fügen Sie das Substrat (BCIP/NBT) hinzu und inkubieren Sie 5-15 min, bis ein gewünschtes Signal sichtbar ist.
   8. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Membran mit ddH₂O spülen.
   9. Trocknen Sie die Membran auf Tissuepapieren und fotografieren Sie mit dem Smartphone (ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 1dargestellt).

2. RT-qPCR zur Messung der Fähigkeit der HDM-Gesamt-RNA bei der Stimulierung der Lungen-ISGs-Expression

1. RNA-Isolierung von Mäusen Lungengewebe
   HINWEIS: Mäuse (weiblich, 8-12 Wochen alt, C57BL/6J) wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten.
   1. Das Tier kurz mit Isofluran ansien und über die intratracheale Instillation mit 5 g (verdünnt in 80 l PBS) von HDM-RNAs, die mit oder ohne RNase III behandelt werden, verabreichen.
   2. Nach 16-18 h nach der HDM-RNA-Behandlung, opfern Sie die Maus durch_{CO2-Inhalation} für ein paar Minuten. Legen Sie dann die Maus auf eine Plattform und heften Gliedmaßen mit Nadeln.
   3. Desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie dann die Haut vom Bauch bis zum Hals mit einer sterilisierten Schere.
   4. Fixieren Sie die Haut mit Nadeln und schneiden Sie die Rippen, um die Lunge freizulegen. Entfernen Sie die gesamte Lunge und waschen Sie sie mit kaltem PBS. Legen Sie die Lunge auf Tissuepapiere und verbrauchen Sie ein kleines Stück von jedem Lungenlappen in ein 2 ml-Rohr mit Perlen (200-300 l im Volumen, 1,4 mm Keramikkugeln).
      HINWEIS: Der Zweck der Verwendung von Keramikperlen ist es, ganze Lungengewebe zu schleifen
   5. Einfrieren der Lungenproben, indem Sie₂ die Tuben für 10 min in einen Flüssigkeits-N2-Behälter legen.
   6. Fügen Sie jedem Röhrchen 500 l Guanidinium-Thiocyanat-basiertes RNA-Isolationsreagenz hinzu und brechen Sie das Lungengewebe mit einem Homogenisator für 45 s. Chill auf Eis zwischen jedem Schritt. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
   7. Befolgen Sie die Schritte 1.1.4- 1.1.7 für die Isolierung der Lungen-RNA.
   8. Das Pellet lufttrocknen und das RNA-Pellet mit der richtigen Menge an RNase-freiem_H2O (ca. 20-30 'L) auflösen.
   9. Messen Sie die RNA-Konzentration, wie in Schritt 1.1.8 beschrieben.
2. RT-qPCR zur Bestimmung der Fähigkeit von HDM-RNA bei der Stimulierung der Lungengenexpression.
   1. Führen Sie die cDNA-Synthese gemäß dem referenzierten Protokoll²⁶durch.
   2. Richten Sie eine RT-qPCR-Reaktion bei 10 l/well für eine 384-Well-Platte mit oben erzeugter cDNA und den genspezifischen Primerpaaren ein (Tabelle 1 und Tabelle 2).
   3. Versiegeln Sie die Brunnen fest mit einem transparenten Klebefilm und wirbeln Sie die Platte für 30 s. Drehen Sie die Platte bei 1.000 x g für 30 s, um Proben an der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
   4. Laden Sie die Platte auf eine RT-qPCR-Maschine und starten Sie die RT-qPCR-Reaktion mit dem Thermocycler-Protokoll (Tabelle 3).
   5. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulationsdatei oder analysieren Sie die Daten mithilfe der Software, die von der Herstellung nach Abschluss des Programms bereitgestellt wird (ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 2dargestellt).

3. FACS-Analyse zur Bestimmung der Auswirkungen von HDM-RNA auf die Infiltration von Eosinophilen in

1. BAL-Flüssigkeitssammlung für FACS-Analyse
   1. Euthanisieren Sie Mäuse (weiblich, 8-12 Wochen alt, C57BL/6J), die mit HDM-Allergenextrakten (nach dem experimentellen Design in Abbildung 3B)durch_{CO2-Inhalation} behandelt wurden.
   2. Legen Sie die Maus auf eine Plattform und pin Gliedmaßen mit Nadeln.
   3. Desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut aus dem oberen Bereich des Bauches bis zum Hals zu schneiden.
   4. Ziehen Sie vorsichtig die Speicheldrüsen und den Sternohyoid-Muskel vorsichtig auseinander mit den Zangen, um die Luftröhre freizulegen. Legen Sie eine Nylonschnur (ca. 10 cm) unter die Luftröhre mit Zangen.
   5. Machen Sie einen Schnitt in der Luftröhre (ca. 2 mm unter dem Kehlkopf) gerade genug, um eine Kanüle einzusetzen. Schneiden Sie die Luftröhre nicht durch. Knoten Sie die Schnur um Luftröhre und Kanüle.
   6. Die Spritze mit 1 ml PBS+EDTA beladen und am Ende der Kanüle befestigen. 1 ml PBS+EDTA in die Lunge injizieren und die Lösung vollständig ansaugen. Die Spritze vorsichtig von der Kanüle lösen und die Lösung in ein 15 ml Rohr auf Eis übertragen.
   7. Laden Sie die Spritze mit dem frischen PBS+EDTA nach und wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
   8. Zentrifugieren Sie das Rohr mit dem gepoolten BAL, das in Schritt 3.1.7 erhalten wurde, um die Zellen bei 500 x g für 7 min bei 4 °C zu pellet. Zeichnen Sie das Volumen der BAL-Flüssigkeit auf und übertragen Sie den Überstand dann auf zwei 1,5 ml-Rohre, ohne das Pellet zu stören.
      HINWEIS: Der Überstand von BAL kann bei -70 °C für zukünftige Analysen, z.B. ELISA, gelagert werden.
   9. Falls es RBCs im Pellet aufgrund einer schweren Lungenentzündung gibt, nach dem Entfernen des Überstandes, fügen Sie 500 l RBC-Lysepuffer hinzu und mischen Sie gut durch Resuspension. Übertragen Sie die Lösung für 7 min bei einer Geschwindigkeit von 500 x g bei 4 °C in ein neues 1,5 ml Rohr und eine Neue Zentrifuge.
   10. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 150 L FACS-Puffer wieder auf.
   11. Die 150 l der resuspendierten Probe in 96-Well-Platte geben und die Platte 7 min bei einer Geschwindigkeit von 500 x g bei 4 °C zentrifugieren.
   12. Schnell, invertieren Sie die Platte auf Gewebepapiere, um die Zellen zu sammeln, die sich an der Unterseite der Brunnen befinden.
   13. Stain die Zellen mit Antikörpern im FACS-Puffer in Gegenwart von 2.4G2 blockierenden Antikörpern (2,5 g / 100 l). Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min an einem dunklen Ort.
   14. Zentrifugieren Sie die Platte nach der Färbung, um die Zellen bei 500 x g für 7 min bei 4 °C zu pellet.
   15. Entfernen Sie die Färbelösung, indem Sie die Platte auf Tissuepapier invertieren und dann waschen, indem Sie sie mit 100 l FACS-Puffer wieder aufhängen. Anschließend zentrieren Sie die Platte wieder bei 500 x g für 7 min bei 4 °C und entfernen Sie den FACS-Puffer, indem Sie die Platte auf Tissuepapier invertieren.
   16. Resuspend Proben in 150 L FACS-Puffer und übertragen Proben in die FACS-Röhren mit 350 L FACS-Puffer. Fügen Sie jeder Probe 25 L Zählperlen hinzu. Proben sind nun für die Analyse der Durchflusszytometrie bereit.
       HINWEIS: Verschiedene Zelltypen in BAL-Flüssigkeit wurden wie angegeben mit Antikörpern gekennzeichnet. Vor dem FACS-Lauf wurden Zählperlen hinzugefügt. Die Flusszytometriedaten wurden mit einer kommerziell erhältlichen Software analysiert. Siehe Abbildung 3 und Tabelle 4 für die Gating-Strategie.
2. Lungengewebeverdauung für die FACS-Analyse
   1. Befolgen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.3.
   2. Schneiden Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals mit einer sterilisierten Schere. Fixieren Sie die Haut mit Nadeln und schneiden Sie die Rippen, um die Lunge freizulegen.
   3. Entfernen Sie die gesamte Lunge und waschen Sie sie mit kaltem PBS. Legen Sie Proben in das 1,5 ml-Rohr, das 50 l Lungenverdauungslösung enthält.
   4. Mit einer gebogenen Schere das Lungengewebe in kleine Stücke zerkleinern. Übertragen Sie das Lungengewebe in eine 6-Well-Platte, dann fügen Sie 8 ml Lungenverdauungslösung hinzu. Legen Sie die Platte 45 min auf einen Shaker in 37 °C Inkubator.
   5. Nach der Inkubation verwenden Sie die Oberseite von 1,5 ml Röhrchen, um das Lungengewebe zu mahlen. Legen Sie ein 70'm-Siebe auf eine neue 6-Well-Platte und tragen Sie die Probe durch 0,22 m Filter auf.
   6. Die gefilterte Lösung in ein 15 ml-Rohr geben, dann die Rohre bei 500 x g 7 min bei 4 °C zentrieren. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 1 ml RBC-Lysepuffer wieder aufsetzen und 3 min auf dem Eis lassen.
   7. Die Probe in 1,5 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 500 x g für 7 min bei 4 °C geben. Wiederholen 2x
   8. Waschen Sie die Lungenzellen 2x mit 1 ml FACS Puffer. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 1 ml FACS-Puffer wieder aufhängen und dann 100 l der Probe in 96 Well-Platte übertragen.
   9. Zentrifugieren Sie die Platte für 7 min bei einer Geschwindigkeit von 500 x g bei 4 °C. Befolgen Sie die in der BAL-Flüssigkeitssammlung für die FACS-Analyse (3.1.13 bis 3.1.16) beschriebenen Schritte, um die Zellen von verdauten Lungengewebeproben zu färben.
      HINWEIS: Eosinophile in der Lunge wurden mit Antikörpern wie angegeben gekennzeichnet und dann mit Zählperlen für weitere FACS-Analysen gemischt. Die Flusszytometriedaten wurden mit zugehöriger Software analysiert. Siehe Abbildung 3 zur Bewertung von HDM-RNA-induzierten Immunantworten.

4. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit einer kommerziell verfügbaren Software durch.
2. Bestimmen Sie die p-Werte durch den ungepaarten zweischwanzigen Schüler-t-Test für den Vergleich zweier Gruppen.
3. Berechnen Sie die absolute Anzahl von Eosinophilen basierend auf Referenzperlen (oberes Panel) mit der Formel

4. Bestimmen Sie die p-Werte durch zweiseitig angelegten ANOVA- und Sidak-Mehrfachvergleichstest für den Vergleich von mehr als zwei Gruppen.
5. Betrachten Sie einen p-Wert kleiner als 0,05 als statistisch signifikant. Die p-Werte werden in Diagrammen als *p <0.05, **p<0.01, ***p<0.001 und ****p<0.0001 angegeben.
   HINWEIS: Alle Pufferrezepte sind in Tabelle 5aufgeführt.

Ergebnisse

Das Vorhandensein von langen dsRNA-Strukturen in HDM, Insekten und Nicht-Insekten-Kleintieren wurde mit einem dsRNA-spezifischen Mausmonoklon-Antikörper J2 (ca. 40bp) mit Punktblot untersucht. RNase III wurde verwendet, um dsRNA in 12–15 bp dsRNA-Fragmente zu verdauen, die durch J2 nicht nachweisbar waren (Abbildung 1).

Die Fähigkeit der HDM-Gesamt-RNA, eine angeborene Immunantwort in der Mauslunge dosisabhängig zu stimulieren, wurde mit RT-qPCR analysiert (<...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie die immunstimulierenden Eigenschaften allergenassoziierter mikrobieller RNA und ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von eosinophiler Lungenentzündung in einem Mausmodell von allergischem Asthma bewertet werden können. Obwohl lange dsRNAs als Replikationszwischenprodukte vieler Viren bekannt sind, die Interferon-Reaktionen in Säugetierzellen wirksam aktivieren können, waren ihre Präsenz in HDM-Allergenen bis zu unserer jüngsten Arbeit^{unbekannt 15}. Die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.40 µm Falcon Cell Strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
1 mL syringes	Henke Sass Wolf	5010.200V0
15 mL Tube	TH.Geyer	7696702
50 mL Tube	TH.Geyer	7696705
70% ethanol	Decon Labs	2701
Absolute Counting Beads	Life Technologies Europe B.V.	C36950
ACK-RBC lysing buffer	Lonza	10-548E
Amersham Hybond-N+ Membrane	GE Healthcare	RPN203B
Ant	San Antonio	Note: Locally collected
Antibody dilution buffer		(see Table 5 for recipe)
Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)	BD Bioscience	560456	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)	BioLegend	117317	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)	eBioscience	15-0193-81	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)	Invitrogen	15-0031-81	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)	BioLegend	103130	1 to 200 dilution
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506	Invitrogen	65-0866-14	1 to 200 dilution
Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate	Promega	S3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)	Invitrogen	11-5931-82	1 to 200 dilution
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)	eBioscience	47-5321-80	1 to 200 dilution
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)	BD Pharmingen	552126	1 to 200 dilution
BCIP/NBT substrate	Thermo Fisher Scientific	PI34042
Blocking Buffer		(see Table 5 for recipe)
Cannual, 20G X 1.5”	CADENCE SCIENCE	9920
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004030
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855485
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500
Cockroach	Greer Laboratories	B26
Counting beads	Thermo Fisher Scientific	01-1234-42
D. farinae	Greer Laboratories	B81
D. pteronyssinus	Greer Laboratories	B82
Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate	Thomas Scientific	1156F03
Digital Dry Bath - Four Blocks	Universal Medical, Inc.	BSH1004
Earthworm	San Antonio	Note: Locally collected
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6511
FACS buffer		(see recipe in Table 5)
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL	STEMCELLTM TECHNOLOGIES	38056
Flow cytometer (BD FACS Celesta)	BD Biosciences
Fly	Greer Laboratories	B8
Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5135
Hemocytometer	Hausser Scientific	3110
HT-DNA	Sigma	D6898
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)	Bio X Cell	BE0307
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708891
Isoflurane	Abbott Labs	sc-363629Rx
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	BP2618500
J2 anti-dsRNA monoclonal antibody	SCICONS	10010200
Lung digestion solution		(see recipe in Table 5)
Lysing Matrix D	MP Biomedicals	116913050-CF
Lysing Matrix D, 2 mL tube	MP Biomedicals	SKU:116913100
Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)	Jackson Laboratory	#000664
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Sigma-Aldrich	30120.094
Microscope	Olympus	CK30
Mini-BeadBeater	Homogenizers	SKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16	Biospec	607
Mosquito	Greer Laboratories	B55
NanoDrop 2000C	Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply	TSCND2000C
Needle, 21 G x 1 1/2 in	BD Biosciences	305167
Non-fat milk	Bio-Rad Laboratories	1706404
Nylon string	Dynarex	3243
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F
RNase III	Thermo Fisher Scientific	AM2290
RNase T1	Thermo Fisher Scientific	AM2283
Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-6802
Shaker or Small laboratory mixer	Boekel Scientific	201100
SPHERO AccuCount Fluorescent	Spherotech	ACFP-70-5	1 to 10 dilution
Spider	San Antonio	Note: Locally collected
TBS		(see recipe in Table 5)
TBS-T		(see recipe in Table 5)
Total cell medium		(see recipe in Table 5)
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
UV Stratalinker 2400 UV	LabX	20447
Wasp	San Antonio	Note: Locally collected