Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

Resumo

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM), geralmente contêm substâncias microbianas que ativam respostas imunes inatas para regular a inflamação alérgica. O protocolo aqui apresentado demonstra a identificação de espécies de dsRNA em alérgenos HDM e caracterização de suas atividades imunogênicas na modulação da inflamação pulmonar eosinofílica.

Resumo

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM) são frequentemente em formas complexas que contêm tanto proteínas alérgicas que impulsionam respostas aberrantes tipo 2 quanto substâncias microbianas que induzem respostas imunes inatas. Esses componentes microbianos associados ao alérgeno desempenham um papel importante na regulação do desenvolvimento de condições inflamatórias tipo 2, como asma alérgica. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem em grande parte indefinidos. O protocolo aqui apresentado determina as características estruturais e a atividade in vivo do RNA imunoestimulatório associado ao alérgeno. Especificamente, alérgenos comuns são examinados para a presença de espécies de RNA de dupla laminada (dsRNA) que podem estimular as respostas de IFN nos pulmões e conter o desenvolvimento de eosinofilia pulmonar grave em um modelo de camundongos de asma alérgica induzida por HDM. Aqui, incluímos os seguintes três ensaios: Mancha de ponto para mostrar as estruturas dsRNA no total de RNA isolado de alérgenos, incluindo espécies HDM, RT-qPCR para medir as atividades de HDM RNA na expressão de genes estimulantes de interferon (ISGs) em pulmões de camundongos e análise FACS para determinar os efeitos do RNA HDM sobre o número de eosinófilos em BAL e pulmão, respectivamente.

Introdução

Com base na hipótese de higiene originalmente proposta por Strachan¹, a exposição infantil a fatores microbianos ambientais, como a endotoxina, pode proteger contra o desenvolvimento de transtornos alérgicos^2,,3. Durante infecções microbianas, por exemplo, infecções virais, a detecção imune inata de ácidos nucleicos estranhos (RNA/DNA) desencadeia respostas de defesa do hospedeiro^4,,5,,6. No entanto, a existência e prevalência de ácidos nucleicos imunogênicos, como espécies de RNA (dsRNA) de dupla-encalhadas em ácaros domésticos (HDM) ou outros alérgenos de insetos permanecem desconhecidas. Este protocolo foi projetado para determinar se os alérgenos hdm ou insetos e não-insetos contêm espécies de dsRNA longas que podem ativar uma resposta imune protetora para neutralizar o desenvolvimento de inflamação pulmonar eosinofílica grave em um modelo de camundongo de asma alérgica. Aqui, fornecemos três métodos simples e rápidos para avaliar os determinantes estruturais no RNA total HDM que são necessários para regular a inflamação pulmonar eosinofílica induzida por alérgenos.

O sistema imunológico mucosa é o maior órgão imunológico do corpo e serve como primeira linha de defesa hospedeira contra infecções microbianas e insultos alérgicos^7,,8. O dsRNA longo, o intermediário de replicação de muitos vírus, é conhecido por funcionar como um padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) para estimular potentemente respostas inatas via Toll like receptor 3 (TLR3) para induzir a expressão de genes estimulados por interferon (ISGs)^{9,,10,,11,12,13,14}. Recentemente, mostramos que o RNA total hdm continha estruturas de dsRNA, o que regulava a expressão dos ISGs e reduzia a inflamação pulmonar eosinofílica grave quando administrado através da instilação intratraqueal em um modelo murino de asma alérgica induzida pelos extratos de HDM¹⁵. A gravidade das inflamações pulmonares é determinada pela análise dos tipos de células imunes na lavagem broncoalveolar (BAL) e no tecido pulmonar através da citometria de fluxo^{16,17,,18,,19,20}.

Este protocolo inclui três ensaios: 1) detecção rápida de estruturas dsRNA com mancha de ponto RNA usando um anticorpo monoclonal de rato J2 que se liga especificamente ao dsRNA (≥40bp) de forma independente de sequência; 2) avaliação rápida para efeitos in vivo do RNA imunoestimulativo nos pulmões do camundongo medindo a indução de ISGs utilizando RT-qPCR; 3) quantificação precisa de eosinófilos em BAL e pulmão no contexto de inflamação pulmonar induzida pelo HDM utilizando a análise da citometria de fluxo.

Os ensaios acima podem ser usados para estudar não apenas doenças pulmonares alérgicas, mas também infecções bacterianas e virais respiratórias. Por exemplo, o anticorpo J2 específico dsRNA também pode ser usado em outras aplicações como cromatografia imunoaffinity, imunohistoquímica, ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining^21,,22,23. Além disso, várias aplicações a jusante da coleta de fluidos BAL podem ser utilizadas para quantificar conteúdos solúveis, como citocinas e quimiocinas usando ELISA, e perfil transcricional de células nas vias aéreas (por exemplo, macrófagos alveolares). Embora existam uma variedade de protocolos disponíveis na literatura para avaliar as condições pulmonares, a maioria desses protocolos muitas vezes se concentra na validação do alvo. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados para identificar componentes em alérgenos ambientais que são importantes para regular o desenvolvimento de doenças alérgicas.

Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas Health San Antonio.

1. Mancha de ponto para mostrar a presença de estruturas dsRNA no RNA total HDM

1. Isolamento total do RNA de alérgenos, insetos e alergênicos não-insetos
   1. Coloque hdm, insetos ou animais não-insetos coletados vivos ou obtidos comercialmente em tubos de 50 mL, e congele rapidamente com líquido-N₂. Em seguida, armazene a -70 °C para posterior isolamento total do RNA.
      NOTA: Neste experimento, foram selecionados animais HDM, insetos e não-insetos porque são conhecidos por serem fontes comuns de alérgenos. Além disso, uma função imunoestimulatória de suas RNAs permanece incerta.
   2. Transfira uma quantidade adequada (equivalente a 100 μL em volume ou menos) de animais HDM, insetos ou não-insetos armazenados a -70 °C em um tubo de 2 mL contendo esferas cerâmicas (esferas cerâmicas de 1,4 mm), em seguida, congele tubos em um recipiente líquido-N₂ por ~10 min.
   3. Para o isolamento total do RNA, adicione 1 mL de reagente de isolamento de RNA à base de tiocianato de guanidinium²⁴ para cada tubo, em seguida, quebre o inseto e animais pequenos não-insetos com um disruptor celular de alta energia na velocidade máxima para 45 s e frio no gelo. Repita este passo duas vezes.
   4. Transfira a solução da etapa 1.1.3 para um novo tubo de 1,5 mL e adicione 200 μL de clorofórmio a cada tubo e vórtice. Tubos centrífugas a 14.000 x g para 14 min a 4 °C.
   5. Uma vez concluída a centrifugação, transfira a fase aquosa superior (200 μL) para um novo tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de isopropanol para precipitar a pelota de RNA. Não perturbe a interfase. A razão de volume recomendada da fase superior versus isopropanol é de 1:2.5.
   6. Misture por vórtice suave, depois tubos de centrífugas a 14.000 x g por 14 min a 4 °C.
   7. Aspire o supernasce com cautela, depois lave a pelota de RNA com 500 μL de 75% de etanol e centrífuga a 7.500 x g por 10 min a 4 °C. Remova todo o líquido com cuidado, seque a pelota e dissolva a pelota de RNA com 20-50 μL de H₂O sem RNase.
   8. Meça a concentração de RNA com um espectrofotômetro usando os seguintes parâmetros:
      1. Abra o software associado e selecione o tipo de ácidos nucleicos para medir. Mude o tipo de amostra para RNA.
      2. Realize a medição em branco com 1-2 μL de H₂O sem RNase. Limpe o H₂O sem RNase. Agora, o instrumento está pronto para a medição.
      3. Carregar 1-2 μL da amostra de RNA e medir a concentração de RNA (μg/μL).
         NOTA: A razão de absorção em 260 e 280 nm (A260/280) em ~2.0 (1.9-2.2) é geralmente aceita como "pura" para RNA. Se não for processado imediatamente, armazene amostras de RNA a -70 °C e evite os ciclos de congelamento para manter o RNA intacto.
2. Detecção da estrutura dsRNA no RNA total usando anticorpo J2 específico dsRNA
   1. Prepare dois 20 μL de amostras de RNA (200 ng/μL). Um com tratamento RNase-III (1 μL para RNA de 1 μg, incubar a 37 °C por 60 min) e o outro sem tratamento RNase-III.
      NOTA: O RNase III é usado aqui para degradar especificamente o dsRNA, mas não o RNA²⁵de uma única linha .
   2. Use um lápis para desenhar grades onde as amostras de RNA serão borradas na membrana.
   3. Ponto 2 μL dos 200 ng/μL da amostra de RNA na membrana de nylon carregada positivamente.
   4. Transligue as amostras à membrana a 1.200 microjoules x 100 em um crosslinker UV. Repita as etapas 1.2.3 e 1.2.4 mais duas vezes no local da amostra. Isso resultará em um total de 0,8 μg por mancha.
      NOTA: Não localmente mais de 2 μL de amostra de RNA na membrana de cada vez.
   5. Bloqueie a ligação não específica com 5% de leite em TBS-T por 1h com agitação à temperatura ambiente. Remova a solução de bloqueio da etapa 1.2.5 e adicione o anticorpo anti-dsRNA J2 na diluição de 1:1.000 em 1% de leite em TBS-T e incubar durante a noite com agitação a 4 °C.
   6. Lave a membrana com TBS-T por 5 minutos e repita esta etapa por 3 vezes. Adicione o anticorpo secundário (Alcalino fosfattase-conjugado Anti-Mouse IgG diluído em 1% de leite 1:5.000) e incubar por 1h em um shaker à temperatura ambiente. Lave a membrana com TBS-T por 5 minutos e repita esta etapa por 3x.
   7. Adicione o substrato (BCIP/NBT) e incubar por 5-15 min até que um sinal desejado seja visível.
   8. Pare a reação enxaguando a membrana com ddH₂O.
   9. Seque a membrana em papéis de tecido e tire uma foto usando um smartphone (um resultado representativo é mostrado na Figura 1).

2. RT-qPCR para medir a capacidade do RNA total HDM no estímulo à expressão dos ISGs pulmonares

1. Isolamento de RNA de tecidos pulmonares de camundongos
   NOTA: Os camundongos (fêmeas, de 8 a 12 semanas, C57BL/6J) foram mantidos em condições específicas sem patógenos.
   1. Anestesia brevemente o animal com isoflurano e administre através da instilação intratraqueal com 5 μg (diluído em 80 μL PBS) de HDM RNAs tratados com ou sem RNase III.
   2. Após 16-18 h pós tratamento HDM RNA, sacrifique o mouse por inalação de CO₂ por alguns minutos. Em seguida, coloque o mouse em uma plataforma e fixe membros com agulhas.
   3. Desinfete o rato com 70% de etanol e corte a pele do abdômen até o pescoço com uma tesoura esterilizada.
   4. Conserte a pele com agulhas e corte as costelas para expor os pulmões. Remova os pulmões inteiros e lave-os com PBS frio. Coloque os pulmões em papéis de tecido e extirve um pequeno pedaço de cada lobo-pulmão em um tubo de 2 mL contendo contas (200-300 μL em volume, esferas cerâmicas de 1,4 mm).
      NOTA: O objetivo do uso de contas cerâmicas é moer tecidos pulmonares inteiros
   5. Congele as amostras de pulmão colocando tubos em um recipiente líquido-N₂ por ~10 min.
   6. Adicione 500 μL de reagente de isolamento de RNA à base de tiocianato de guanidinium em cada tubo e quebre os tecidos pulmonares com um homogeneizador para 45 s. Esfrie no gelo entre cada passo. Repita este passo duas vezes.
   7. Siga os passos 1.1.4- 1.1.7 para isolamento do RNA pulmonar.
   8. Seque a pelota e dissolva a pelota de RNA com a quantidade adequada de H₂O sem RNase (~20-30 μL).
   9. Meça a concentração de RNA conforme descrito na etapa 1.1.8.
2. RT-qPCR para determinar a capacidade do RNA HDM em estimular a expressão genética pulmonar.
   1. Utilizando 100 ng/μL de RNA extraído dos tecidos pulmonares como modelo, realize a síntese de cDNA de acordo com o protocolo referenciado²⁶.
   2. Configure uma reação RT-qPCR a 10 μL/well para uma placa de 384 poços usando cDNA gerada acima e os pares de primer específicos de genes(Tabela 1 e Tabela 2).
   3. Sele os poços firmemente com um filme adesivo transparente e vórtice da placa por 30 s. Gire a placa a 1.000 x g por 30 s para coletar amostras na parte inferior dos poços.
   4. Carregue a placa em uma máquina RT-qPCR e comece a executar a reação RT-qPCR usando o protocolo de cicloviário térmico(Tabela 3).
   5. Exporte os resultados em um arquivo de planilha ou analise os dados usando o software fornecido pela manufatura após a conclusão do programa (um resultado representativo é mostrado na Figura 2).

3. Análise FACS para determinar os efeitos do RNA HDM na infiltração de eosinófilos em BAL e pulmão

1. Coleta de fluidos BAL para análise FACS
   1. Camundongos eutanizais (fêmeas, 8-12 semanas de idade, C57BL/6J) que foram tratados com extratos de alérgenos HDM (de acordo com o desenho experimental mostrado na Figura 3B) por inalação de CO_2.
   2. Coloque o mouse em uma plataforma e fixe membros com agulhas.
   3. Desinfete o rato com 70% de etanol. Use uma tesoura para cortar a pele da parte superior do abdômen até o pescoço.
   4. Suavemente, puxe as glândulas salivares e o músculo esternoide cuidadosamente separado usando os fórceps para expor a traqueia. Coloque uma corda de nylon (~10 cm) sob a traqueia usando fórceps.
   5. Faça uma incisão na traqueia (~2 mm sob a laringe) apenas o suficiente para inserir uma cânula. Não corte a traqueia. Nó a corda em torno de traqueia e cânula.
   6. Carregue a seringa com 1 mL de PBS+EDTA e anexe-a à extremidade da cânula. Injete 1 mL de PBS+EDTA no pulmão e aspire completamente a solução. Retire a seringa da cânula cuidadosamente e transfira a solução para um tubo de 15 mL no gelo.
   7. Recarregue a seringa com o PBS+EDTA fresco e repita esta etapa 2x.
   8. Centrifugar o tubo contendo o BAL agrupado obtido na etapa 3.1.7 para pelotar as células a 500 x g por 7 min a 4 °C. Regisso o volume do fluido BAL e transfira o supernante para dois tubos de 1,5 mL sem perturbar a pelota.
      NOTA: O supernatante de BAL pode ser armazenado a -70 °C para análise futura, por exemplo, ELISA.
   9. No caso de haver RBCs presentes na pelota devido a inflamação pulmonar grave, após a remoção do supernascimento, adicione 500 μL de tampão de lise RBC e misture bem com a resuspensão. Transfira a solução para um novo tubo de 1,5 mL e centrífuga por 7 min a uma velocidade de 500 x g a 4 °C.
   10. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 150 μL de tampão FACS.
   11. Transfira os 150 μL da amostra resuspended em placa de 96 poços e centrifugar a placa por 7 minutos à velocidade de 500 x g a 4 °C.
   12. Rapidamente, inverta a placa em papéis de tecido para coletar as células que residem na parte inferior dos poços.
   13. Manche as células com anticorpos no tampão FACS na presença de anticorpos bloqueadores de 2,4G2 (2,5 μg / 100 μL). Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos em um lugar escuro.
   14. Após a coloração, centrifufique a placa para pelotar as células a 500 x g por 7 min a 4 °C.
   15. Remova a solução de coloração invertendo a placa em papel de tecido e depois lave resususus com 100 μL de tampão FACS. Em seguida, centrifugar a placa novamente a 500 x g por 7 min a 4 °C e remover o tampão FACS invertendo a placa em papel de tecido.
   16. Resuspend amostras em 150 μL de tampão FACS e transferir amostras para os tubos FACS contendo 350 μL de tampão FACS. Adicione 25 μL de contas de contagem a cada amostra. As amostras estão prontas para análise de citometria de fluxo.
       NOTA: Vários tipos de células em fluido BAL foram rotulados com anticorpos conforme indicado. As contas de contagem foram adicionadas antes da execução do FACS. Os dados de citometria de fluxo foram analisados por meio de um software comercialmente disponível. Consulte a Figura 3 e a Tabela 4 para a estratégia de gating.
2. Digestão do tecido pulmonar para a análise FACS
   1. Siga os passos 3.1.1 - 3.1.3.
   2. Corte a pele do abdômen até o pescoço com uma tesoura esterilizada. Conserte a pele com agulhas e corte as costelas para expor os pulmões.
   3. Remova os pulmões inteiros e lave-os com PBS frio. Coloque amostras no tubo de 1,5 mL contendo 50 μL de solução de digestão pulmonar.
   4. Pique os tecidos pulmonares em pequenos pedaços com uma tesoura curvada. Transfira os tecidos pulmonares para uma placa de 6 poços, depois adicione 8 mL de solução de digestão pulmonar. Coloque a placa em um agitador na incubadora de 37 °C por 45 min.
   5. Após a incubação, use o tubo superior de 1,5 mL para moer os tecidos pulmonares. Coloque uma placa de 70 μm em uma nova placa de 6 poços e aplique a amostra através de um filtro de 0,22 μm.
   6. Transfira a solução filtrada para um tubo de 15 mL e, em seguida, centrífugue os tubos a 500 x g por 7 min a 4 °C. Aspire o supernasciente e resuspense a pelota em 1 mL de tampão de lise RBC e deixe-a no gelo por 3 minutos.
   7. Transfira a amostra para tubo de 1,5 mL e centrífuga a 500 x g por 7 min a 4 °C. Repita 2x
   8. Lave as células pulmonares 2x com tampão FACS de 1 mL. Aspire o supernasal e resuspenque a pelota em 1 mL de tampão FACS e, em seguida, transfira 100 μL da amostra em placa de 96 poços.
   9. Centrifugar a placa por 7 min a uma velocidade de 500 x g a 4 °C. Siga os passos descritos na coleta de fluidos BAL para análise facs (3.1.13 a 3.1.16) para manchar as células de amostras de tecido pulmonar digerido.
      NOTA: Os eosinófilos nos pulmões foram rotulados com anticorpos como indicado, depois misturados com contas de contagem para posterior análise facs. Os dados de citometria de fluxo foram analisados por meio de software associado. Consulte a Figura 3 para avaliar as respostas imunes induzidas pelo RNA do HDM.

4. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando um software comercialmente disponível.
2. Determine os valores p por teste T de estudante de duas caudas não verificados para a comparação de dois grupos.
3. Calcule os números absolutos de eosinófilos com base em contas de referência (painel superior) usando a fórmula

4. Determine os valores p por duas vias ANOVA e sidak teste de comparações múltiplas para a comparação de mais de dois grupos.
5. Considere um valor p menor que 0,05 como estatisticamente significativo. Os valores p são indicados em parcelas como *p <0,05, **p<0.01, ***p<0.001 e ****p<0.0001.
   NOTA: Todas as receitas de buffer são fornecidas na Tabela 5.

Resultados

A presença de estruturas de dsRNA longas em HDM, insetos e animais pequenos não-insetos foi examinada por mancha de ponto usando um anticorpo monoclonal de camundongos específico dsRNA J2 (≥ 40bp). RNase III foi usado para digerir dsRNA em fragmentos de dsRNA de 12 a 15 bp, que eram indetectáveis por J2 (Figura 1).

A capacidade do RNA total hdm de estimular uma resposta imune inata nos pulmões do camundongo de forma dependente de dose foi analisada por RT-q...

Discussão

O protocolo atual descreve como avaliar as propriedades imunoestimulatórias do RNA microbiano associado ao alérgeno e seus impactos no desenvolvimento da inflamação pulmonar eosinofílica em um modelo de camundongo de asma alérgica. Embora os DSRNAs longos sejam conhecidos como intermediários de replicação de muitos vírus que podem potencialmente ativar respostas de interferon em células de mamíferos, suas presenças em alérgenos HDM têm sido desconhecidas até nosso trabalho recente¹⁵

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.40 µm Falcon Cell Strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
1 mL syringes	Henke Sass Wolf	5010.200V0
15 mL Tube	TH.Geyer	7696702
50 mL Tube	TH.Geyer	7696705
70% ethanol	Decon Labs	2701
Absolute Counting Beads	Life Technologies Europe B.V.	C36950
ACK-RBC lysing buffer	Lonza	10-548E
Amersham Hybond-N+ Membrane	GE Healthcare	RPN203B
Ant	San Antonio	Note: Locally collected
Antibody dilution buffer		(see Table 5 for recipe)
Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)	BD Bioscience	560456	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)	BioLegend	117317	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)	eBioscience	15-0193-81	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)	Invitrogen	15-0031-81	1 to 200 dilution
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)	BioLegend	103130	1 to 200 dilution
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506	Invitrogen	65-0866-14	1 to 200 dilution
Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate	Promega	S3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)	Invitrogen	11-5931-82	1 to 200 dilution
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)	eBioscience	47-5321-80	1 to 200 dilution
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)	BD Pharmingen	552126	1 to 200 dilution
BCIP/NBT substrate	Thermo Fisher Scientific	PI34042
Blocking Buffer		(see Table 5 for recipe)
Cannual, 20G X 1.5”	CADENCE SCIENCE	9920
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004030
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855485
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500
Cockroach	Greer Laboratories	B26
Counting beads	Thermo Fisher Scientific	01-1234-42
D. farinae	Greer Laboratories	B81
D. pteronyssinus	Greer Laboratories	B82
Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate	Thomas Scientific	1156F03
Digital Dry Bath - Four Blocks	Universal Medical, Inc.	BSH1004
Earthworm	San Antonio	Note: Locally collected
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6511
FACS buffer		(see recipe in Table 5)
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL	STEMCELLTM TECHNOLOGIES	38056
Flow cytometer (BD FACS Celesta)	BD Biosciences
Fly	Greer Laboratories	B8
Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5135
Hemocytometer	Hausser Scientific	3110
HT-DNA	Sigma	D6898
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)	Bio X Cell	BE0307
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708891
Isoflurane	Abbott Labs	sc-363629Rx
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	BP2618500
J2 anti-dsRNA monoclonal antibody	SCICONS	10010200
Lung digestion solution		(see recipe in Table 5)
Lysing Matrix D	MP Biomedicals	116913050-CF
Lysing Matrix D, 2 mL tube	MP Biomedicals	SKU:116913100
Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)	Jackson Laboratory	#000664
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Sigma-Aldrich	30120.094
Microscope	Olympus	CK30
Mini-BeadBeater	Homogenizers	SKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16	Biospec	607
Mosquito	Greer Laboratories	B55
NanoDrop 2000C	Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply	TSCND2000C
Needle, 21 G x 1 1/2 in	BD Biosciences	305167
Non-fat milk	Bio-Rad Laboratories	1706404
Nylon string	Dynarex	3243
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F
RNase III	Thermo Fisher Scientific	AM2290
RNase T1	Thermo Fisher Scientific	AM2283
Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-6802
Shaker or Small laboratory mixer	Boekel Scientific	201100
SPHERO AccuCount Fluorescent	Spherotech	ACFP-70-5	1 to 10 dilution
Spider	San Antonio	Note: Locally collected
TBS		(see recipe in Table 5)
TBS-T		(see recipe in Table 5)
Total cell medium		(see recipe in Table 5)
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
UV Stratalinker 2400 UV	LabX	20447
Wasp	San Antonio	Note: Locally collected