In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

Zusammenfassung

Tumorigenese ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem Zellen Fähigkeiten erwerben, die ihr Wachstum, überleben und verbreiten unter feindlichen Bedingungen ermöglichen. Verschiedene Tests zielen darauf ab, diese Merkmale von Krebszellen zu identifizieren und zu quantifizieren; Sie konzentrieren sich jedoch häufig auf einen einzigen Aspekt der zellulären Transformation, und tatsächlich sind mehrere Tests für ihre korrekte Charakterisierung erforderlich. Ziel dieser Arbeit ist es, Forschern eine Reihe von Instrumenten zur Verfügung zu stellen, um die zelluläre Transformation in vitro aus einer breiten Perspektive zu bewerten und so fundierte Schlussfolgerungen zu ziehen.

Eine nachhaltige proliferative Signalaktivierung ist das Hauptmerkmal von Tumorgeweben und kann leicht unter In-vitro-Bedingungen überwacht werden, indem die Anzahl der im Laufe der Zeit erreichten Bevölkerungsverdoppelungen berechnet wird. Außerdem ermöglicht das Wachstum von Zellen in 3D-Kulturen ihre Interaktion mit umgebenden Zellen, ähnlich dem, was in vivo vorkommt. Dies ermöglicht die Bewertung der zellulären Aggregation und zusammen mit der immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von ausgeprägten zellulären Markern, Um Informationen über ein weiteres relevantes Merkmal der Tumortransformation zu erhalten: den Verlust der richtigen Organisation. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal transformierter Zellen ist ihre Fähigkeit, ohne Bindung an andere Zellen und an die extrazelluläre Matrix zu wachsen, die mit dem Anker-Assay ausgewertet werden kann.

Detaillierte experimentelle Verfahren zur Bewertung der Zellwachstumsrate, zur immunfluoreszenzenten Kennzeichnung von Zelllinienmarkern in 3D-Kulturen und zur Erprobung des verankerungsunabhängigen Zellwachstums in weichem Agar werden bereitgestellt. Diese Methoden sind für primäre Epithelzellen (BPEC) der Brust aufgrund ihrer Relevanz bei Brustkrebs optimiert; Nach einigen Anpassungen können jedoch Prozeduren auf andere Zelltypen angewendet werden.

Einleitung

Für die Entwicklung von Neoplasma sind mehrere aufeinanderfolgende Ereignisse erforderlich. Im Jahr 2011 beschrieben Hanahan und Weinberg 10 Fähigkeiten, die das Wachstum, überleben und die Verbreitung transformierter Zellen ermöglichen: die sogenannten "Hallmarks of Cancer"¹. Die hier beschriebene Methodik stellt drei verschiedene Werkzeuge zur Bewertung der in vitro zellulären Transformation zusammen, indem sie sich auf einige der Besonderheiten der Tumorzellen konzentriert. Diese Techniken bewerten die Zellproliferationsrate, das Verhalten von Zellen, wenn sie in 3D kultiviert werden, und ihre Fähigkeit, Kolonien mit Ankerunabhängigkeit zu b....

Protokoll

Menschliche Proben, die in den folgenden Experimenten verwendet wurden, wurden aus Reduktionsmammoplastiken gewonnen, die in der Clénica Pilar Sant Jordi (Barcelona) im Rahmen der Standardprozedur-Genehmigung durchgeführt wurden. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Verfahren in einem biologischen Sicherheitskabinett der Klasse II durchgeführt.

1. In-vitro-Kultur der menschlichen Brustepithelzellen und Wachstumskurven-Plot-Aufbau

1. In-vitro-Kultur der primären Epithelzellen der Brust (BPECs): Zellpassaging
   HINWEIS: Für BPEC-Ableitung und Zellkultur folgen Sie den Anweisungen von Ince et al., 2007<....

Ergebnisse

Ein experimentelles Modell der zellulären Transformation mit der Einführung von drei genetischen Elementen in BPECs wurde gewählt, um repräsentative Ergebnisse der onkogenen Transformation zu generieren^6,7 ( Abbildung3). Nicht transformierte BPECs (N) wurden aus krankheitsfreiem Brustgewebe abgeleitet, wie von Ince und Kollegen⁶ beschrieben und gemäß dem hier angegebenen Protoko.......

Diskussion

Die in diesem Papier beschriebenen experimentellen Protokolle bieten nützliche Instrumente zur Bewertung der onkogenen Transformation von In-vitro-kulturierten Zellen. Jede Technik bewertet bestimmte Aspekte des Transformationsprozesses, und daher muss bei der Schlussfolgerungausarbeit aus einer einzigen Analyse besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Wachstumskurven-Aufbau ist ein Ansatz, der Informationen erfordert, die bereits verfügbar sind, wenn Zellen für andere Zwecke kultiviert werden. Das macht diese Techn.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture