Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Résumé

Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.

Résumé

Tumorigenesis est un processus en plusieurs étapes dans lequel les cellules acquièrent des capacités qui permettent leur croissance, survie et diffusion dans des conditions hostiles. Différents tests visent à identifier et quantifier ces caractéristiques des cellules cancéreuses; cependant, ils se concentrent souvent sur un seul aspect de la transformation cellulaire et, en fait, plusieurs tests sont nécessaires pour leur caractérisation appropriée. Le but de ces travaux est de fournir aux chercheurs un ensemble d’outils pour évaluer la transformation cellulaire in vitro d’un point de vue large, permettant ainsi de tirer des conclusions solides.

Une activation proliférative soutenue de signalisation est la principale caractéristique des tissus tumoraux et peut être facilement surveillée dans des conditions in vitro en calculant le nombre de doublons de population réalisés au fil du temps. En outre, la croissance des cellules dans les cultures 3D permet leur interaction avec les cellules environnantes, ressemblant à ce qui se passe in vivo. Ceci permet l’évaluation de l’agrégation cellulaire et, avec l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs cellulaires distinctifs, d’obtenir l’information sur une autre caractéristique pertinente de la transformation tumorale : la perte de l’organisation appropriée. Une autre caractéristique remarquable des cellules transformées est leur capacité à croître sans attachement à d’autres cellules et à la matrice extracellulaire, qui peut être évaluée avec l’analyse d’ancrage.

Des procédures expérimentales détaillées pour évaluer le taux de croissance cellulaire, pour effectuer l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs de lignée cellulaire dans les cultures 3D, et pour tester la croissance cellulaire indépendante de l’ancrage chez les agars mous sont fournies. Ces méthodologies sont optimisées pour les cellules épithéliales primaires du sein (BPEC) en raison de sa pertinence dans le cancer du sein; cependant, les procédures peuvent être appliquées à d’autres types de cellules après quelques ajustements.

Introduction

Plusieurs événements successifs sont nécessaires pour le développement du néoplasme. En 2011, Hanahan et Weinberg ont décrit 10 capacités qui permettent la croissance, la survie et la diffusion des cellules transformées : les « caractéristiques du cancer^{» 1}. La méthodologie décrite ici compile trois outils différents pour évaluer la transformation cellulaire in vitro en se concentrant sur certaines des caractéristiques distinctives des cellules tumorales. Ces techniques évaluent le taux de prolifération cellulaire, le comportement des cellules lorsqu’elles sont cultivés en 3D et leur capacité à former des colonies avec l’indépendance de l’ancra....

Protocole

Des échantillons humains utilisés dans les expériences suivantes ont été obtenus à partir de mammoplasties de réduction réalisées à Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelone) sous le consentement standard de la procédure. Toutes les procédures sont effectuées dans un cabinet de sécurité biologique de classe II, sauf indication contraire.

1. Culture in vitro des cellules épithéliales mammaires humaines et accumulation de parcelles courbes de croissance

1. Culture in vitro des cellules épithéliales primaires du sein (BPECs) : passage cellulaire
   REMARQUE : Pour la dérivation et la culture cellulaire du BPEC, suiv....

Résultats

Un modèle expérimental de transformation cellulaire avec l’introduction de trois éléments génétiques dans les BPEC a été choisi pour générer des résultats représentatifs de la transformation^{oncogène 6,7} (Figure 3). Les BPECs non transformés (N) ont été dérivés du tissu mammaire sans maladie tel que décrit par Ince et ses^{collègues 6} et cultivés suivant le protoco.......

Discussion

Les protocoles expérimentaux décrits dans cet article fournissent des outils utiles pour évaluer la transformation oncogène des cellules de culture in vitro. Chaque technique évalue des aspects spécifiques du processus de transformation et, par conséquent, une attention particulière doit être accordée lors de l’élaboration de conclusions à partir d’une seule analyse. L’accumulation des courbes de croissance est une approche qui exige des informations déjà disponibles lors de la culture des cellules à.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture