Diese Arbeit wurde durch das OD Grant R24OD031956 des NIH unterstützt. Wir danken Samantha Jalbert, Jill Ralston und Cora Anderson für ihre Hilfe und Unterstützung sowie unseren Redakteuren und anonymen Peer-Reviewern für ihr hilfreiches Feedback

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt. Die repräsentativen Ergebnisse sind sowohl für ein perfundiertes als auch für ein nicht durchblutetes reifes Albino-Männchen Xenopus laevis dargestellt.
1. Experimentelle Vorbereitung 
HINWEIS: Wenn vor der Probenahme das Perfusionsprotokoll8 befolgt wird, fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasietechnik genehmigt hat.</li>
	<li>Eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricain-Methansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat (siehe Materialtabelle) herstellen. Das Volumen muss größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig abzudecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.</li>
	<li>Führen Sie eine primäre Sterbehilfe durch, indem Sie den Xenopus in die Euthanasielösung legen; Das Tier bleibt insgesamt 1 h unter Wasser.</li>
	<li>Richten Sie die Präparierstation so ein, dass alle Gewebe unmittelbar nach der Probenahme in gekühltem PBS oder 0,7x PBS9 (je nach experimentellem Bedarf) gespült, kontrolliert und unter einem Licht mit 5-facher (oder mehr) Vergrößerung getrimmt werden können. Diese Station muss es dem Benutzer auch ermöglichen, entweder alle Zangen und Scheren auszutauschen oder sie zwischen den Anwendungen sauber zu wischen.</li>
	<li>Sobald sich der Frosch 1 h in der Lösung befunden hat, ist die primäre Sterbehilfe abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion, indem Sie einen Fuß kneifen.</li>
	<li>Notieren Sie die entsprechenden Details für das Tier, wie z. B. Art, Stamm, Geschlecht, Alter und Gesundheitszustand sowie ob es perfundiert wurde. Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie zusätzliche Messungen vor, wie z. B. die Länge der Schnauze.</li>
	<li>Setzen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie die Gliedmaßen proximal zum Körper fest (Abbildung 1).</li>
	<li>Schneide mit einer Präparierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, wobei du zwei Laschen machst.</li>
	<li>Identifizieren Sie in Abbildung 2 die Linea alba und greifen Sie sie mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Zölomhöhle weg. Die Muskulatur vorsichtig mit einer Schere durchschneiden. Machen Sie zwei Laschen aus der Hohlwand. Schneiden oder stecken Sie alle Laschen aus dem Weg.</li>
	<li>Identifiziere das Herz, das noch schlagen wird. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Coracoidknochen zu verkleinern (Abbildung 2), um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten. HINWEIS: Wenn das Herz vor der Probenahme aufgehört hat zu schlagen, ist zu beachten, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.</li>
</ol>2. Probenahme
HINWEIS: Wenn das Tier durchblutet wurde, fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
<ol><li>Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange straff (Abbildung 3).</li>
	<li>Perforieren Sie das Perikard vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu durchtrennen. Schälen Sie das Perikard von den 3 Kammern des Herzens ab.</li>
	<li>Fassen Sie den Ventrikel mit einer Pinzette an der Spitze, identifizieren Sie, wo er an den Ohrmuscheln und dem arteriellen Stamm befestigt ist (Abbildung 4) und schneiden Sie ihn unterhalb dieser Ansätze ab (Abbildung 5). Trimmen Sie den Ventrikel bei Bedarf so, dass kein Gewebe aus den Ohrmuscheln oder dem arteriellen Stamm sichtbar ist und im Inneren des Ventrikels noch helles Klappengewebe sichtbar ist. HINWEIS: Bei nicht durchbluteten Tieren kann die Entfernung des Ventrikels als sekundäre Euthanasie eingestuft werden.</li>
	<li>Die 3 Leberlappen sind sichtbar (Abbildung 6 und Abbildung 7). Fassen Sie die Lippe des linken Lappens (rechts des Betrachters) und heben Sie sie vorsichtig an, so dass die Leber- und Zystengänge sichtbar sind (Abbildung 8). Nehmen Sie Proben aus dem unteren 1/3 des Lappens unterhalb dieser Aufsätze (Abbildung 9).</li>
	<li>Um einen besseren Zugang zum Gewebe eines weiblichen Frosches zu erhalten, ist es hilfreich, den Eierstock zu entfernen. Identifizieren Sie den Eierstock, der von einer Schicht viszeralem Peritoneum umhüllt ist, die als Keimepithel bezeichnet wird. Verschieben Sie die Lappen vorsichtig, bis sie auf den jeweiligen Seiten liegen, um den Bereich der Befestigung sichtbar zu machen (Abbildung 10). Diese Ansätze befinden sich direkt ventral der paarigen Niere.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Schere die Eierstöcke so nah wie möglich an den Nieren, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 11).</li>
	<li>Untersuchen Sie den Mediallappen (auch Frontlappen genannt) der Leber und beachten Sie, wie er durch das Mesenterium und den Ductus hepatopancreaticum (auch gemeinsamer Gallengang genannt) mit dem Magen und dem Zwölffingerdarm verbunden ist (Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8).</li>
	<li>Durchtrennen Sie das Mesenterium, das Ligamentum hepatoduodenalis mit einer Iridektomieschere sowie den Gang hepatopankreaticus an der Stelle, an der er auf den Zwölffingerdarm trifft. Die Verbindung der Bauchspeicheldrüse und des Ductus hepatopancreaticus mit dem Mediallappen der Leber wird durchtrennt, so dass kein dunkles Lebergewebe anhaftet (Abbildung 12).</li>
	<li>Fassen Sie den Magen mit einer Zahnzange und das obere Ende der Bauchspeicheldrüse mit einer Gewebezange. Bei 5-facher Vergrößerung die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Magen abziehen (Abbildung 13). HINWEIS: Wenn es sich nicht sauber löst, ist das verbleibende Pankreasgewebe sichtbar und kann in Fragmenten abgerissen werden. Alternativ kann die Bauchspeicheldrüse methodisch mit einer Iridektomieschere und einer Gewebezange abgelöst werden.</li>
	<li>Identifizieren Sie in Abbildung 14A die Harnblase und entfernen Sie sie, indem Sie so nah wie möglich an der Kloake schneiden. Entsorgen Sie dieses Taschentuch.</li>
	<li>Identifizieren Sie in Abbildung 14B den Dickdarm und ziehen Sie ihn straff, um den Dickdarm so nah wie möglich an der Kloake zu durchtrennen. Entfernen und entsorgen Sie den gesamten Verdauungskanal, indem Sie das Bauchfell durchtrennen, wo es an der Milz befestigt ist. Die Fettkörper werden nun vollständig zugänglich sein.</li>
	<li>Toupieren Sie die Fettkörper auseinander, so dass sie auf den jeweiligen Seiten liegen. Der Bereich über der Niere, wo der Fettkörper mit dem Bauchfell verbunden ist, wird sichtbar sein. Fassen Sie die Basis des linken Fettkörpers (rechts des Betrachters) und schneiden Sie ihn mit einer Schere vom Bauchfell ab, wobei Sie einen kleinen Rand lassen, damit die Niere nicht beschädigt wird (Abbildung 15).</li>
	<li>Entfernen Sie den restlichen Fettkörper und entsorgen Sie ihn. Die gekoppelten Nieren sind nun vollständig sichtbar.</li>
	<li>Bei weiblichen Fröschen oder Männchen mit ausgeprägten verkümmerten Eileitern fassen Sie einen Eileiter und ziehen ihn von der Niere und der Kloake weg (Abbildung 16). Schneide den Eileiter an der Stelle, an der er auf die Kloake trifft, und ziehe ihn weiter von der Niere weg, wobei du alle durchsichtigen Peritonealansätze durchtrennst, sobald sie sichtbar werden. Entsorgen Sie dieses Taschentuch.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem restlichen Eileiter.</li>
	<li>Die Nieren sind noch mit klarem Peritoneum (retroperitoneal)10 bedeckt. Fassen Sie die Nieren mit einer Zange und durchtrennen Sie das Bauchfell an ihrem unteren Ende.</li>
	<li>Heben Sie die Nieren aus der Zölomhöhle und durchtrennen Sie das Peritoneum mit einer Schere so nah wie möglich an den Nieren, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 17).</li>
	<li>Schneiden Sie bei 5-facher Vergrößerung überschüssiges Bauchfell und anderes restliches Gewebe (Fettkörper, Milz) weg. Wenn es sich bei dem Frosch um ein Weibchen handelt, stellen Sie sicher, dass das restliche Eierstockgewebe entfernt wird (Abbildung 18). Wenn es sich um einen männlichen Frosch handelt, entfernen Sie vorsichtig den Hoden und suchen Sie nach einem verkümmerten Eileiter, der ohne Vergrößerung möglicherweise nicht sichtbar ist (Abbildung 19).</li>
	<li>Entfernen Sie die Stifte vom Tier, drehen Sie es auf sein Ventral und stecken Sie die Gliedmaßen des Tieres wieder fest.</li>
	<li>Wählen Sie eine der hinteren Gliedmaßen aus, aus denen die Probe entnommen werden soll, und stecken Sie den Fuß dieser Gliedmaße fest.</li>
	<li>Entfernen Sie einen mandelförmigen Hautlappen über dem Gastrocnemius/Tibiofibula (Abbildung 20).</li>
</ol>

Standardisiertes Dissektions- und Probenahmeprotokoll für adulte Xenopus-Organe

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Da dieses Protokoll darauf abzielt, die Frische zu maximieren, können einige Proben unerwünschtes Gewebe enthalten. Zum Beispiel werden der Ductus hepatopankreaticus und einige Mesenterien mit der Bauchspeicheldrüse entnommen, und etwas Peritonealgewebe, Nebennieren und Harnleiter werden immer mit den paarigen Nieren entnommen.  Wenn die Frische keine Rolle spielt, kann mit modifizierten Techniken eine genauere Probenahme erreicht werden.
Das Aussehen und die Lage der Organe sind zwischen ...

Obwohl die "digitale Dissektion" von adultem Xenopus" verfügbar ist1, bleibt die replizierbare Organ- und Gewebeentnahme von adultem Xenopus ohne die detaillierte Anleitung, die für andere adulte Modelle (z. B. Mäuse 2,3,4) verfügbar ist, eine Herausforderung. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine klare Anleitung für eine genaue und replizierbare Organprobenahme von adulten Xenopus zu geben, ähnlich wie sie derzeit für ihre Larven verfügbar ist5. Der Schwerpunkt liegt auf der einfachen Vervollständigung, um maximale Aktualität zu erhalten und das Protokoll für alle Benutzer zugänglich zu machen.
Obwohl es eine gründliche Sezieranleitung für Rana sp.6 sowie zahlreiche Präparieranleitungen für andere Anurans7 gibt, ist derzeit keine Xenopus-Präparier- und Probenahmeanleitung verfügbar. Für diejenigen, die mit den Probenahmepraktiken oder der Anatomie von Amphibien nicht vertraut sind, machen die kleinen Unterschiede zwischen Xenopus und anderen Anuren diese Ressourcen suboptimal für replizierbare Gewebeproben.
Viele wertvolle Gewebe sind nicht enthalten und werden in diesem Leitfaden sogar verworfen; Dies dient dazu, die Frische des Gewebes zu gewährleisten. Sechs Proben sind begrenzt genug, um sicherzustellen, dass diese Gewebe in weniger als einer Stunde nach Beginn des Herzschlags entnommen werden können, unabhängig von der Erfahrung oder dem Können des Benutzers. Fortgeschrittenere und detailliertere Anleitungen zum Sammeln vieler anderer Taschentücher sind als separate Begleitpapiere in Vorbereitung.
Für weniger erfahrene Anwender wird immer empfohlen, dieses Protokoll zuerst an Tieren zu versuchen, die aus anderen Gründen als Experimenten euthanasiert werden, bevor Tiere entnommen werden, die schwer zu ersetzen sind (z. B. Transgene, Tiere fortgeschrittenen Alters usw.). Im Idealfall sind alle beprobten Tiere gesund und, wenn es sich um weibliche Tiere handelt, in den letzten zwei Wochen keinen Eisprung gehabt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus ist seit über hundert Jahren ein leistungsfähiger Modellorganismus für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Während die experimentelle Analyse und die Präparierungstechniken des Embryos gut dokumentiert sind, wurden die Beschreibungen der adulten Xenopus-Strukturen und -Organe sowie die Techniken für die Arbeit mit adulten Embryonen nicht aktualisiert, um den Anforderungen moderner Ansätze wie der quantitativen Proteomik und der Einzelzell-Transkriptomik Rechnung zu tragen. Die zelltyp- und genzentrierte Perspektive erfordert einen Kontrast zu Beobachtungen in embryonalen Stadien und in adulten Geweben. Die Organe der Larve erleiden signifikante Veränderungen in ihrer Gesamtstruktur, Morphologie und anatomischen Lage während des Übergangs von der Larve zum Erwachsenen, vor allem während des massiven Metamorphose-Umbaus. Die Etablierung robuster Standards für die Identifizierung und Dissektion von Organen ist von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Datensätze, die aus Studien stammen, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, konsistent sind. Das vorliegende Protokoll identifiziert sechs der Organe im adulten Xenopus und demonstriert Verfahren zur Dissektion und Probenahme des Herzventrikels, der Leber, des Fettkörpers, der Bauchspeicheldrüse, der paarigen Niere und der Haut des adulten Xenopus. Abhängig von den Konservierungsmethoden können die präparierten Organe für die quantitative Proteomik, Einzelzell-/Kern-Transkriptomik, in situ Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie usw. verwendet werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Gewebeentnahme zu standardisieren und Untersuchungen der adulten Organsysteme in mehreren Laboren zu erleichtern.

Unter Verwendung von Abbildung 1 bis Abbildung 20 und unter Befolgung aller Schritte dieses Protokolls wurden der Herzventrikel, der linke Leberlappen, die Bauchspeicheldrüse, die linken Fettkörper, die paarigen Nieren und ein Hautlappen innerhalb einer Stunde nach der Euthanasie sauber herausgeschnitten. Innerhalb dieser Zeit werden die Proben gespült und getrimmt, so dass sie erscheinen, wie in Abbildung 21 gezeigt.
<p clas...

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Autor im Rampenlicht: Standardisierung der Gewebeprobenahme in der Proteomik und Immunchemie

Dieser Artikel stellt einen Leitfaden für die Probenahme von sechs wichtigen und unterschiedlichen Organen bei erwachsenen Xenopus vor, auf die schnell und einfach zugegriffen werden kann: Herzventrikel, Leberlappen, Bauchspeicheldrüse, Fettkörper, paarige Nieren und Haut.

Techniken zur schnellen Probenahme von sechs wichtigen Organen bei erwachsenen Xenopus

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Vor dieser Arbeit habe ich ein Protokoll für die schnelle Perfusion von Amphibien entwickelt. Dieses Protokoll sollte vor der Probenahme für Forschungszwecke wie Proteomik und Immunchemie verwendet werden, bei denen das Vorhandensein übermäßiger Blutmengen im Gewebe unerwünscht ist. Obwohl es viele Diagramme und andere Hilfsmittel gibt, gibt es derzeit keine umfassenden Anleitungen, wie Gewebe aus adultem Xenopus schnell und zuverlässig präpariert werden kann.Wir hoffen, dass standardisierte Probenahmetechniken es Laboren ermöglichen werden, Gewebe einfach auszutauschen. Dies ist besonders vorteilhaft in Situationen, in denen der Import und Export von Tieren aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit oder Versandbeschränkungen nicht möglich ist.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

772 Aufrufe.  Harvard Medical School. Vor dieser Arbeit habe ich ein Protokoll für die schnelle Perfusion von Amphibien entwickelt. Dieses Protokoll sollte vor der Probenahme für Forschungszwecke wie Proteomik und Immunchemie verwendet werden, bei denen das Vorhandensein übermäßiger Blutmengen im Gewebe unerwünscht ist. Obwohl es viele Diagramme und andere Hilfsmittel gibt, gibt es derzeit keine umfassenden Anleitungen, wie Gewebe aus adultem Xenopus schnell und zuverlässig präpariert werden kann.Wir hoffen, dass s...

Serie: Autor im Rampenlicht: Standardisierung der Gewebeprobenahme in der Proteomik und Immunchemie

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Nicht-Terminal-Blut-Stichprobenverfahren bei Meerschweinchen

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Rückenmarkstransektion bei Xenopus laevis Kaulquappen

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...