Bereiten Sie sich zwei Tage nach der Transfektion der primären Hippocampus-Neuronen auf die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop vor. Erwärmen Sie den Lebendzellkammeraufsatz 60x subjektiv und das Linsenöl auf 37 Grad Celsius und äquilibrieren Sie die Kammer auf 5 % CO2. Identifizieren Sie mit den Okularen transfizierte Neuronen in dem Kanal, der das Frachtprotein enthält.
Klicken Sie anschließend auf Scannen, um die Neuronen abzubilden und das Axon-Anfangssegment des SCI-5-Kanals zu identifizieren. Legen Sie das Sichtfeld auf ein rechteckiges Feld von 32 x 128 Pixeln fest, und verschieben Sie es, um eine Region des Axons abzubilden, die 50 bis 150 Mikrometer vom Anfangssegment des Axons entfernt ist. Notieren Sie die Richtungsabhängigkeit des Frachttransports und die Ausrichtung des ROI und klicken Sie dann auf Speichern unter, um ihn als Datei zu speichern.
Beachten Sie, dass die Punkte auf dem Feld in den nachfolgenden Bildern oben und rechts angezeigt werden. Nehmen Sie die Seite des Bildes auf, die dem Zellkörper am nächsten ist, und die Seite, die dem Axonterminus am nächsten ist, um die korrekte Ausrichtung der Komagraph-Polylinie sicherzustellen. Stellen Sie die Laserleistung von 561 auf 1,40, die Lochblende auf 7,8, die Größe auf 128 Pixel im Quadrat und die Geschwindigkeit auf 32 Bilder pro Sekunde ein.
Passen Sie die Verstärkung an, um den Transport einzelner Frachtvesikel zu visualisieren, ohne durch Hintergrundsignale verdeckt zu werden. Wählen Sie im Dropdown-Menü ROI die Option Rechteckigen ROI zeichnen aus und zeichnen Sie den ROI so, dass er das gesamte Sichtfeld abdeckt. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie Als Stimulation verwenden ROI S1. Klicken Sie dann auf der Registerkarte ND-Setup auf Bild aufnehmen, um das Referenzbild vor der Stimulation zu erfassen.
Stellen Sie dann die Stimulation auf ROI S1, das Intervall auf keine Verzögerung, die Dauer von 1,64 Sekunden und die Loops auf sieben ein. Klicken Sie dann auf Bild erfassen, um das Referenzbild nach der Stimulation zu sammeln. Wählen Sie Warten, keine Akquisition, zwei Minuten, um eine Erholungsphase für fluoreszierende Fracht bereitzustellen, um den gebleichten ROI wieder aufzufüllen.
Wählen Sie das Erfassungsintervall, keine Verzögerung, Dauer fünf Minuten, Schleifen, 8, 615. Klicken Sie auf der Registerkarte ND-Setup auf die Schaltfläche Stimulationseinstellungen anwenden, gefolgt von Jetzt ausführen. Sammeln Sie auch Transportvideos von zwei Neuronen zur Analyse.
Setzen Sie das Sichtfeld auf das gesamte Bild zurück und erfassen Sie dann ein Bild des vollständigen Neurons in den Kanälen 561 und 647 mit der ROI-Box. Notieren Sie die XY-Koordinaten, an denen das Bild aufgenommen wurde, um die Proteinexpression nach der Fixierung zu bestätigen. Die Bildgebung lebender Zellen eines transfizierten Neurons, das das Frachtprotein mAPL's Synaptophysin exprimiert, wurde unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt.
Die externe Domäne des Neurofasins im Axon-Anfangssegment wurde ebenfalls gekennzeichnet. Die Bildgebung des Gütertransports wurde in der axonalen Region von Interesse durchgeführt. Weitere Immunfluoreszenzanalysen nach der Bildgebung bestätigten die Koexpression des Tau-Proteins und des mAPL-Synaptophysins.
