Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01 HL109420 zu WM und AHA 9320033N zu LY unterstützt.

Maus und allogenen Transplantats syngene Transplantationsmodell Alle Tierversuche wurden von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschüsse der Yale-Universität genehmigt. Für Allograft Modell wurden Segmente der Aorta von männlichen, 4-5 Wochen alten WT (C57BL/6J) oder IFN-&amp;ggr; R-KO-Mäusen in der Bauchaorta der weiblichen Empfänger, 8-12 Wochen alten WT zwischengeschaltet mit eine End-to -Ende mikrochirurgischen Anastomosentechnik (siehe nächste für Details). Für syngene Transplantat Modell Segmente der Brust-Aorten von männlichen, 4-5 Wochen alten WT-Mäusen in die Bauchhöhle Aorten von männlichen eingefügt wurden, 8-12 Wochen alte IFN-γR1-KO mit einer End-to-End-mikrochirurgischen Anastomosentechnik. Nach 1 Woche postoperativ wurden die Tiere mit iv Ad5.CMV-Maus-IFN-γ oder Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) geimpft bei 1 x 10 9 PFU. Serum Maus-IFN-γ wurden durch ELISA (eBioscience) gemessen bei 1 und 5 Wochen nach Adenovirus-Verabreichung. Bestimmte Tiere erhielten BrdU(Sigma-Aldrich) bei 100 mg / kg sc für 2 Wochen vor der Tötung. End-to-End-mikrochirurgischen Anastomosentechnik (Video wird für diesen Teil genommen werden): 1. Donor Vorgehensweise <ol><li> Anesthetize der Donor-Mäusen mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). </li><li> Nachdem sichergestellt wurde, eine adäquate Anästhesie, legen Sie die Donormäusen unter dem Operationsmikroskop an X8-30 Vergrößerung auf einem Tablett in Rückenlage, und verwenden Jod Prep Pad und Alcohol Prep Pad für Brustwand Vorbereitung. </li><li> Inzision der vorderen Brustwand über den Rippen und der Membran, um das Herz freizulegen. </li><li> Öffne das rechte Atrium injizieren 10 ml heparinisiertes (100 U / ml) Kochsalzlösung in die linke Herzkammer, um die Mäuse mit einer 10-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel zu spülen. </li><li> Resezieren das Herz und die Lungen über die gesamte Länge der Aorta freizulegen. </li><li> Präparieren Sie die Aorta sorgfältig, um die direkte Gewalteinwirkung, whil minimierene identifizieren, abzubinden und teilen die Holz Äste mit 11-0 Naht in der Nähe der Aorta. </li><li> Sobald der Aorta ist frei von umgebenden Gewebe, Verbrauchsteuern die ganze Aorta zur Transplantation. </li><li> Spülen Sie das abgeschnittene Ende des Spenders Aorta mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung, und bewahren Sie sie in der gleichen Lösung auf Eis (bis 6 Stunden) bis zur Transplantation. </li></ol> 2. Empfänger Vorgehensweise <ol><li> Injizieren Sie den Empfänger Mäuse mit ip Ketoprofen (5 mg / kg) zur Analgesie und thenanesthetize die Mäuse ip mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Die Empfänger-Mäuse sind tief narkotisierten innerhalb von 10 Minuten für eine Dauer von 60-90 min. Während der Operation wird der Pegel der Anästhesie alle 15 min durch Einklemmen des vorderen Bauchwand oder Fuß mit einer Pinzette beurteilt. Wenn das Tier reagiert auf die Schmerzreize jederzeit während der Operation, wird eine zusätzliche Dosis von Ketamin und Xylazin (1/4 oder 1/3 ursprünglichen Dosis) von sc oder im verabreicht werden </li><li> Nachdem sichergestellt wurde, eine adäquate Anästhesie, abrasieren das Fell in der vorderen Bauchwand mit einem elektrischen Rasierer, reinigen Sie die Haut mit Jod Prep Pad und Alkohol Prep Pad, decken Sie die Augen mit Augensalbe. Während der Operation werden die folgenden aseptische Techniken für die Operationen, einschließlich der Reinigung des OP-Tisch mit 10% Bleichmittel, sterile Handschuhe und mit sterilisierten Instrumente Mikrochirurgie (Dampf-sterilisierten Instrumente für den Beginn der Operation, dann heiß Glasperle sterilisiert werden Instrumente zwischen mehreren Operationen, etc.). </li><li> Legen Sie die Empfänger-Mäusen unter dem Operationsmikroskop bei einer Vergrößerung von X8-30 auf einem Tablett in Rückenlage. </li><li> Inzision der Bauchdecke an der Mittellinie von Xyphoid auf Schambein, und die Ausbreitung der Bauchdecke auseinander mit einem Mikro-Retraktor die Bauchhöhle aussetzen. </li><li> Klappen Sie den Darm superior und wickeln mit Gaze angefeuchtet mit Kochsalzlösung. Die Empfängermäuse geworden durch den Verlust von hea gekühltt durch ausgelagerten Darm. Es ist wichtig, tierischen Wärme aufrechtzuerhalten. Allerdings ist die Heizplatte nicht während der Operation verwendet als bescheiden Hypothermie ist der Vorteil bei der Verhinderung von Rückenmarksverletzungen beim Verschluss von Aorten Blutfluss wie dort ist ineffizient Wärmeübertragung mit fehlender Durchblutung der unteren Hälfte der Mäuse Körper. </li><li> Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior, wickeln Sie die Bauch Bereichen Empfängermäuse mit Kochsalzlösung-Lösung befeuchteten Gaze, und es verwenden, um das Rektum zu rechten Seite des Bauches zurückzuziehen. Die freiliegenden Gewebe werden in regelmäßigen Abständen mit einer Salzlösung während der Transplantation bewässert. </li><li> Dissect unverblümt ein Segment infrarenalen Aorta zwischen der renalen Gefäß proximal und distal Aortenbifurkation und getrennt von der unteren Hohlvene (IVC) sorgfältig. </li><li> Identifizieren und abzubinden all der kleinen Zweige, die aus diesem Segment der Bauchaorta mit 11-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterial. </li><li> Kreuzklemme das isolierte Segment einbdominal Aorta mit zwei Gefäßklemmen ungefähr 5 mm auseinander, einer an jedem Ende. </li><li> Transekt die Bauchaorta zwischen den Klemmen mit scharfen Mikro-Schere, um die Anastomosen erstellen. </li><li> Resezieren ein kleines Segment der Aorta abdominalis (bis zu 0,4 mm in der Länge) von einem abgeschnittenen Ende der durchtrennten Aorta Empfänger, den Spender Aortentransplantat unterzubringen. </li><li> Spülen Sie die Aortasegmente zwischen den Klemmen mit Heparin Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen. Die Aortasegmente zwischen den Klemmen und dem Spender Aortentransplantat periodisch mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung (bis zu 40 ml / kg) während Anastomose bewässert. </li><li> Durchschneiden beide Seiten Spender Aorta mit scharfen Mikro-Schere, um ein Segment Transplantat von 2,5 mm in der Länge für die Transplantation zu erstellen. </li><li> Platzieren des Spenders Aortentransplantat in der orthotopic Position anastomose des Spenders Transplantats proximalen und distalen Ende an den Empfänger der proximalen und distalen Schnittfläche der abdominalen Aorta, die jeweils mit einem Ende-to-End-Muster mit 11-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterial. </li><li> Für die kontinuierliche Nähte, legen Sie die Nähte Aufenthalt bei 3 und 9 Uhr-Position zunächst. Zwischen zwei Haltefäden an jeder Seite des Transplantats, binden anastomose beide Schnittkanten in 3-4 Stiche mit den fortlaufenden Nähten, und die laufenden Nähte Nähte mit einem doppelten Knoten bleiben. Da beide Schichten des Verschlusses kontinuierlich sind, wird die Dehiszenzrisiko erhöht. Der Spender Aortentransplantat sollte in geeigneter Länge sein, dem Empfänger proximalen und distalen abgeschnittene Ende Bauchaorta verbinden. </li><li> Für die Knopfnähte konstruieren vier Anastomose bei 3 und 9 Uhr-Position an beiden Seiten des Transplantats einerseits und anastomosieren beide Schnittkanten in 3-4 Stiche zwischen zwei Haltefäden an jeder Seite des Transplantats. </li><li> Lassen Sie den Haken, um den distalen retrograden Fluss in Transplantats ermöglichen, identifizieren die blutenden Stellen und zusätzliche Stiche innerhalb von 3 Minuten. </li><li> Nach der Feststellung zufrieden Hämostase, lassen Sie die proximalen Klemme. </li><li> Bestätigen Durchgängigkeit des Transplantats durch das Vorhandensein von starkem Pulsation in dem Transplantat und dem proximalen benachbarten Segment des nativen Bauchaorta, insbesondere im distalen benachbarten Segment der Aorta und A. mesenterica inferior. Betrachten Thrombose in Anastomosen wenn das Pulsieren innerhalb von wenigen Minuten nach der Wiederherstellung des Blutflusses zu verringern. </li><li> Zurück in den Darm in die Bauchhöhle. </li><li> Naht schließen Sie die Bauchdecke mit 5-0 Nylon Naht in Muskulatur und die Haut Schicht, beziehungsweise. </li><li> Legen Sie die Empfänger-Mäuse in einem sauberen Käfig auf der Spitze eines Heizkissen, und warten Sie 1-2 Stunden für die Mäuse wieder zu Bewusstsein und erholen sich von der Narkose. Es ist wichtig, Tier ausreichend Wärme während der Wiederherstellung erhalten. Halten Sie die Mäuse in der warmen und trockenen Käfig vor tierischen Gefolge aus der Narkose. </li><li> Bewerten Sie die motorische Funktion der Hinterbeine nach Mäusen Erholung, und wieder am zweiten Tag. Eine erfolgreiche Transplantation Chirurgie bestätigt werden if keine Funktionsstörung Hinterbeine in Empfängermäuse am zweiten Tag beobachtet. </li><li> Verwalten Sie die Empfänger-Mäusen mit Ketoprofen in Trinkwasser (5 mg / kg / d = 27 ug / ml im Trinkwasser) für 48 Stunden. Falls Empfängermäuse von Schmerzen unrelieved leiden durch die postoperative Analgetika wie durch den Verlust der Mobilität, das Versagen der Bräutigam, abnorme Körperhaltung gebündelt, etc belegt, werden sie eingeschläfert werden. Die Tiere werden in vordefinierten Endpunkte nach 1-60 Tagen eingeschläfert werden. </li></ol> Graft-Analyse Artery Transplantate in Allograft wurden bei 4 Wochen und Transplantate in syngene Transplantat Modell beschafft waren 6 Wochen postoperativ (5 Wochen nach der viralen Infektion) und mittels Standard histologische Techniken für Elastica-van Gieson (EVG)-Färbung, Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung und Immunofluoreszenzfärbung. Bilder wurden mit einer Immunfluoreszenzmikroskop System (Zeiss). Zellzählung der Kerne durch positive Immunfärbung umgeben war durchführened bei starker Vergrößerung und gemittelt aus 5 Querschnitte für jedes Transplantat. Die Graft-Bereich Messungen des Lumen (im Endothel), Intima (zwischen Endothel und innere elastische Lamina, IEL), Medien (zwischen IEL und externen elastischen Lamina, EEL), Wandstärke (zwischen Endothel und externen elastischen Lamina) und ganze Gefäß (im AAL) wurden von 5 seriellen Querschnitte, 150 um voneinander für jedes Transplantat berechnet Hilfe computergestützter Bildanalyse und NIH Bild 1.60 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/nih-image</a> ). Statistische Analyse Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Two-tailed wurden gepaarte t-Tests und ein Zwei-Wege-ANOVA-Analyse unter Verwendung der Prism Software (GraphPad Software). Unterschiede mit p &lt;0,05 wurden als statistisch signifikant anzuzeigen.

<ol>
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Proc. 37, 2886-2887 (2005).</li><li>Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenic+activity+of+interferon+gamma+on+growth-arrested+human+vascular+smooth+muscle+cells.">Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells.</a> Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).</li><li>Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP1+prevents+graft+arteriosclerosis+by+inhibiting+IFN-&#947;-dependent+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion.">AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-&#947;-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion.</a> Cir. Res. 109, 418-427 (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die beschriebenen Protokolle werden auf der Maus GA-Modelle konzentriert. Die Verfahren können zu anderen Transplantat Transplantation Modelle herangezogen werden. Diese Modelle sind mit humanisierten Xenograft (dh menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen eingefügt) und akute Abstoßung Maus GA-Modell (dh eine Maus Aorta aus einer genetischen Belastung in eine andere genetische Belastung Empfänger). Unsere Maus beschriebenen Modelle sind für die ...

Graft arteriosclerois (GA), die auch als Transplantatvaskulopathie, eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen, die durch diffuse umlaufende Stenose der gesamte Pfropfcopolymerisat Gefäßbaumes 7, dadurch entwickelt. Frühe Stadien kann exzentrisch und fokale Stenosen, die mehr offensichtlich sind in den Arterien, also mehr ähnelt Stenosen in konventionellen Atherosklerose gesehen. Das Lumen Verlust der Transplantatgefäße Ergebnisse Intima Ausdehnung durch Infiltration von Wirts-T-Zellen und Makrophagen, insbesondere die Ansammlung von extrazellulärer Matrix und glatte Muskulatur-ähnlichen Zellen stammten aus Transplantat Host oder beide 5, 13, 19, die unzureichend kompensiert wird durch äußere Gefäß Umbau. In Herz-Transplantate sind die meisten klinisch relevanten Veränderungen, die in den epikardialen und intramyokardialen Koronararterien. Letztlich wird GA der Herzkranzgefäße führen ischämischer Herzinsuffizienz. GA ist die Hauptursache für Herz-spät grachtern Verlust. Die Stenosen GA an den Nahtlinien zu stoppen, stark verwickelt den Host als Antwort auf Alloantigene Transplantat in der Pathogenese und uns dazu GA als eine Form der chronischen Abstoßung 3 einzuordnen. Jedoch können auch andere Formen der arteriellen Verletzung erhöhen das Risiko von GA, entweder durch die Erhöhung der Netto-Belastung durch Verletzungen oder durch Intensivierung und / oder Modulation der alloimmune Antwort. Die Endothelzellen (EC) Auskleidung der Arterien Transplantat wird in menschlichen GA erhalten, und die meisten oberflächlichen Regionen der Intima neben dem EG-Futter ist der Standort am stärksten von host-IFN-γ abgeleiteten-produzierende T-Zellen und Makrophagen infiltriert 11; in Einige Patienten GA mit der Entwicklung von Donor-spezifische Alloantikörper, die Transplantat EC 16 aber die Gefäße binden zugeordnete zeigen wenig Beweise für die fibrinoid Nekrose, die charakteristisch für akute Antikörper-vermittelten Abstoßung 11 ist. Die wichtigste Komponente ist die GA PathogeneseProliferation von glatten Muskelzellen, wie Zellen in der Intima, wenn dieser Prozess arretiert werden kann, ist unwahrscheinlich, GA voran. Frühere Arbeiten aus unserer Gruppe hatten gezeigt, dass Intimas der menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogene der Arterie Spender und dass dieser Prozess erweitern zwischengeschaltet könnte durch Neutralisieren menschlichen gehemmt werden IFN- γ 18. Weiterhin exogenen humanen IFN-γ könnte Intima (und medial) glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC)-Proliferation in diesen arteriellen Grafts in Abwesenheit von humanen T-Zellen 15, 17. (Es ist wichtig zu beachten, dass Mensch und Maus IFN-γ nicht überqueren Spezies auszuschließen indirekte Auswirkungen auf die Mäusewirt in diesem experimentellen System.) Diese humanisierten Mausmodellen haben den Vorteil, rekapituliert humanen T-Zell / vaskuläre Zell-Interaktionen und die Intima Läsionen weitgehend von menschlichen (zB Transplantat-derived) Zellen,wie in klinischen Proben beobachtet, aber nicht vollständig zusammenzufassen die klinische Situation, weil sie die Rolle der Host Makrophagen und möglicherweise anderen Zelltypen in organspenderelevante Läsionen beteiligt ignorieren. Eine herkömmliche Maus-Modell des Prozesses könnte theoretisch dieses Problem anzugehen, ergänzen die Grenzen des humanisierten Modell für einen vollständigen Immunsystem des Wirts und die Bereitstellung der zusätzliche Vorteil, dass die Kraft der Maus genetische Methoden angewendet werden, um Ga. Die beiden am häufigsten verwendeten Mausmodelle beinhalten heterotope Herztransplantation und orthotopen Transplantation 1 Arterie. Die Läsionen, die in den Arterien heterotoper Herztransplantate entwickeln werden weitgehend von Wirtszellen, wahrscheinlich von Knochenmark Ursprungs, während Intimazellen der Arterien im menschlichen Herzen Transplantate überwiegend von Transplantat Ursprung 5, 13, 19. Dies ist ein wesentlicher Unterschied, der führte uns zu alternativen Mausmodelle entwickeln hat. Zwischenschaltungeine Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger ist noch geringer als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen, da das Zell-vermittelten akuten Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei 19 Wochen. Demzufolge sind die nachfolgenden Änderungen in der dazwischen Gefäßsegment gesehen nur eine Antwort von Wirtszellen, die das Gefäß dezellularisierte Gerüst neu besiedelt haben, wodurch eine sehr artifactual Situation von begrenzter Bedeutung als Modell für die Veränderungen im Transplantat Schiffe, die in der Klinik auftreten. Wir haben vor kurzem zwei neue Mausmodelle entwickelt, um diese Probleme zu umgehen 21. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Das zweite Modell beinhaltet Zwischenschaltung einer Arterie Ausschnitt aus einem Wildtyp C57BL/6J Maus Spender in einem Host-Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die rec fehlteptor für IFN-γ (IFN-&amp;ggr; R-KO) durch die Verabreichung von Maus gefolgt IFN-γ (geliefert über Infektion der Leber der Maus mit einem adenoviralen Vektor. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle und die Vorteile unserer Maus GA-Modelle.

<table border="1" >
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6J (H-2b)</td>
 <td>Jackson Laboratories 
 (Bar Harbor, ME)</td>
 <td>000664</td>
 <td>Donor (5 weeks) 
 Recipient (8-12weeks)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine Hydrochloride Injection </td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-2053</td>
 <td>Storage Solution(50 mg/ml) 
 Working Solution(5 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Xylazine Sterile Solution</td>
 <td>Lloyd Inc.</td>
 <td>NADA# 139-236</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution(1 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen</td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution-oral 
 (0.027 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium</td>
 <td>Sagent Pharmaceticals</td>
 <td>NDC 25021-400</td>
 <td>Storage Solution(1000 U/ml) 
 Working Solution(100 U/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)</td>
 <td>CareFusion</td>
 <td>AL4109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride Injection</td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td>To prepare the anesthetic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petrolatum Ophthalmic Ointment </td>
 <td>Dechra Veterinary Products</td>
 <td>NDC 17033-211-38</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine Prep Pads </td>
 <td>Triad Disposables, Inc.</td>
 <td>NDC 50730-3201-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Prep Pads</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>NDC 68599-5805-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MZ95</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Scissors</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5693</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>15009-08</td>
 <td>To transect the aorta of donor or recipient </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Narrow Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>14088-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle Holder/Forceps</td>
 <td>MICRINS</td>
 <td>MI1542</td>
 <td>To hold the needle</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>11254-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11251-35</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11000-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>13011-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LANCASTER Eye Speculum</td>
 <td>Zepf Medical Instruments</td>
 <td>42-1209-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Vascular Clip</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-6472</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Polyamide Monofilament Suture</td>
 <td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
 <td>Cat #T4A10Q07</td>
 <td>10-0 suture, Needle=70 microns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Monofilament Nylon Suture</td>
 <td>Syneture 
 (Covidien)</td>
 <td>SN-1956</td>
 <td>6-0 suture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-Woven Songes</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>Reorder No. 94442000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309659</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309657</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18G 1 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305196</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25G 7/8, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hearting Pad</td>
 <td>Sunbeam</td>
 <td>Z-1228-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trimmer</td>
 <td>Wahl</td>
 <td>9854-500</td>
 <td></td>
 </tr>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
</tr>
 </tbody>
</table>

mouse models for graft arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), auch genannt Transplantatvaskulopathie, ist eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen durch diffuse, umlaufende Stenose des gesamten Transplantat Gefäßbaum dadurch entwickelt. Die wichtigste Komponente ist die Pathogenese GA Proliferation von glatten Muskelzellen-ähnlichen Zellen in der Intima. Wenn ein menschlicher Koronararterien-Segment in die infra-renale Aorta von immundefizienten Mäusen eingefügt ist, könnten die Intimas in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogen der Arterie Spender oder exogenen humanen IFN-γ in Abwesenheit von humanen T-Zellen. Werden erweitern Zwischenschaltung einer Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen beschränkt, da die akute zellvermittelte Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei Wochen. Wir haben vor kurzem zwei neue m entwickeltOUSE Modelle, um diese Probleme zu umgehen. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Transplantat-Abstoßung in diesem Fall werden nur gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene von dem Y-Chromosom (in der männlichen, nicht aber die weiblich) und der Abstoßungsreaktion dass ausreichend träge spenderabhängig abgeleitet glatten Muskelzellen für mehrere Wochen erhalten erfolgt kodiert ist. Das zweite Modell beinhaltet Anordnen einer Arterie Segment von einer Wildtyp-Maus C57BL/6J Spender in einen Wirt Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die den Rezeptor für fehlt IFN-γ durch Verabreichung gefolgt Maus IFN-γ (geliefert durch Infektion der Maus Leber mit einem adenoviralen Vektor. Es gibt keine Ablehnung in diesem Fall als Spender und Empfänger Mäuse des gleichen Stammes und Geschlecht, sondern Spender glatten Muskelzellen proliferieren als Reaktion auf die Zytokin während host-abgeleiteten Zellen fehlt Rezeptor fürdieses Zytokin, sind nicht mehr reagiert. Durch Rückkreuzung zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender können beide Modelle verwendet werden, um die Wirkung von spezifischen Genen auf GA Verlauf zu beurteilen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für unsere Maus GA-Modelle.

Maus Allotransplantat Arteriosklerose (GA) ein: In diesem Modell wird ein männlichen Spenders Aorta in weibliche Empfänger transplantiert, so dass die Host-alloreaktive T-Zell-vermittelte Reaktionen induziert alloimmune gegen eine kleinere Y-Antigen (die männlich-spezifische Antigen Nebenhistokompatibilitäts HY) ausgedrückt auf das Transplantat 12 und wiederum T IFN-γ Antriebe VSMC Proliferation 20, wie in anderen Allografttransplantation Modelle 2 beobachtet, 6, 8-10 un...

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Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.

Mausmodelle für Graft Arteriosklerose

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.

Serie: Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Forschung

Medizin

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins (HDL). It has been recognized that high levels of plasma ApoCIII constitutea risk factor for cardiovascular diseases (CVD). Elevated plasma ApoCIII level often correlates with insulin resistance, obesity, and hypertriglyceridemia. Invaluable knowledge on the roles of ApoCIIIin lipid metabolisms and CVD has been obtained from transgenic mouse models including ApoCIII knockout (KO) mice; however, it is noted that the metabolism of lipoprotein in mice is different from that of humans in many aspects. It is not known until now whether elevated plasma ApoCIII is directly atherogenic. We worked to develop ApoCIII KO rabbits in the present study based on the hypothesis that rabbits can serve as a reasonablemodelfor studying human lipid metabolism and atherosclerosis. Zinc finger nuclease (ZFN) sets targeting rabbit ApoCIIIgene were subjected to in vitro validation prior to embryo microinjection. The mRNA was injected to the cytoplasm of 35 rabbit pronuclear stage embryos, and evaluated the mutation rates at the blastocyst state. Of sixteen blastocysts that were assayed, a satisfactory 50% mutation rate (8/16) at the targeting site was achieved, supporting the use of Set 1 for in vivo experiments. Next, we microinjected 145 embryos with Set 1 mRNA, and transferred these embryos to 7 recipient rabbits. After 30 days gestation, 21 kits were born, out of which five were confirmed as ApoCIII KO rabbits after PCR sequencing assays. The KO animal rate (#KO kits/total born) was 23.8%. The overall production efficiency is 3.4% (5 kits/145 embryos transferred). The present work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits. These ApoCIII KO rabbits are novel resources to study the roles of ApoCIII in lipid metabolisms.

Recent development in gene targeting tools makes production of knockout (KO) rabbits possible. In the present work, we generated five Apolipoprotein (Apo) C-III KO rabbits using Zinc Finger Nucleases (ZFN). This work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits.

Die Produktion von Apolipoprotein C-III-Knockout Kaninchen mit Zink-Finger-Nukleasen

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Maus Nierentransplantation: Modelle der Transplantatabstoßung

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vein Interposition Modell: ein geeignetes Modell zur Untersuchung Bypass Graft Durchgängigkeit

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Verwendung einer chemischen Biopsie zur Graft-Qualitätsbewertung

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination model can be used for the evaluation of treatment methods for intrathoracic diseases such as lung cancer or malignant pleural mesothelioma.
Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is a recently developed cancer treatment strategy that combines the specificity of tumor-targeting antibodies with toxicity caused by a photoabsorber (IR700Dye) after exposure to NIR light. The efficacy of NIR-PIT has been reported using various antibodies; however, only a few reports have shown the therapeutic effect of this strategy in an orthotopic model. In the present study, we demonstrate an example of efficacy evaluation of the pleural disseminated lung cancer model, which was treated using NIR-PIT.

Near-infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) is an emerging cancer therapeutic strategy that utilizes an antibody-photoabsorber (IR700Dye) conjugate and NIR light to destroy cancer cells. Here, we present a method to evaluate the antitumor effect of NIR-PIT in a mouse model of pleural disseminated lung cancer and malignant pleural mesothelioma using bioluminescence imaging.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...