Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).

1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica <ol><li> Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento de tamaño similar (situado debajo de la tabla de cortar). </li><li> Ratón toracostomía preparación del tubo (Figura 1). Una longitud de 10 cm de tubo PE 50 (Intramedic, diámetro interno 0,58 mm, diámetro exterior 0,965 mm) se corta. Un extremo está unido al extremo romo de una aguja de calibre curvo 23; esta aguja se utiliza para pasar el tubo a través de la pared torácica (interior → exterior) antes del cierre de la ventana torácica. El extremo distal del tubo (1,5 cm de longitud, opuestas a la adjunta calibre 23aguja) es repetidamente pinchado con una aguja de calibre 30, la creación de &quot;puertos secundarios&quot; para facilitar una eficaz aspiración de aire intratorácica. Esta porción fenestrado es entonces separada del resto del tubo por varios bucles circunferenciales de sutura de seda 4:00; estos bucles servirá como un &quot;tapón&quot;, en última instancia, el anclaje de los 1,5 cm fenestrado porción dentro de la cavidad torácica. </li><li> Catéteres venosos yugulares. Dos 15 cm de longitud de tubo de PE 10 (Intramedic, diámetro interno 0,28 mm, diámetro exterior 0,61 mm) se cortan. Se utiliza un bisturí para biselar los extremos del tubo, lo que aumenta la facilidad de la venopunción. El tubo se vacía a través de una jeringa de 1 ml que contenía 6% 150 kDa solución de dextrano (en PBS) unido al extremo no biselado de la tubería. </li><li> Chest preparación ventana de la pared (Figura 2). Membrana transparente de polivinilideno (New Kure Wrap, Kuresha, Tokio) se corta en una forma ovalada (eje principal 6 cm, eje menor 4 cm). Una circular de 5 mm # 1 cubreobjetos (Bellco) se fija a la membrana utilizando α-cianoacrilato pegamento (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf). </li><li> . Tubo para la inducción de neumotórax (&quot;tubo de soplado&quot;) A 10 cm de longitud de tubo (diámetro interior 3 mm, diámetro exterior de 5 mm) se une a una jeringa de 5 ml, y el extremo opuesto se utiliza para introducir aire dentro de la jaula para animales torácica antes de injerto ventana de la pared torácica. </li><li> Jeringa para la inmersión en agua de objetivo. Una aguja de calibre 23 está unido a una jeringa de 30 ml que contiene agua destilada. La punta de la aguja está embotado (usando una lima de metal) con el fin de evitar daños en el objetivo. </li></ol> 2. Ratón Anestesia <ol><li> Un ratón se anestesia con una mezcla de ketamina (10 mg / ml) y xilazina (2 mg / ml), administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 8 l por gramo de peso corporal del ratón. La sedación se produce a menos de 3 - 6 min y no debe impedir la respiración espontánea. </li><li> Usando una máquina de afeitar eléctrica, afeitarsela garganta, el pecho, el abdomen, y el lado derecho del ratón. </li><li> Con cinta, asegure el ratón a un tablero plástico de corte fino. El jefe del ratón debe apuntar hacia el operador (Figura 3). Tensión suave proporcionada por un bucle de sutura que pasa por debajo de los dientes superiores sirve para mantener la extensión de la cabeza. El tablero de corte se coloca sobre una almohadilla térmica, manteniendo euthermia ratón durante la traqueotomía y la colocación del catéter venoso. </li><li> Moje las zonas rasuradas con un 100% de etanol. </li><li> Confirme anestesia adecuada con una pizca de cola / pata. Proceda si la respuesta mínima, proporcionar un bolo adicional de si no ketamina / xilazina adecuadamente anestesiado. </li></ol> 3. Traqueostomía <ol><li> Se hace una incisión de 1 cm sobre la garganta. Tejido conectivo subyacente se disecciona, y las glándulas salivales se separan y se refleja lateralmente. El músculo esternohioideo inmediatamente anterior a la tráquea se reseca. </li><li> Un bucle de sutura 04:00 se hace avanzar bajo the tráquea (Figura 4). El bucle se corta entonces, la creación de dos filamentos separados de sutura que subyacen a la tráquea. La sutura de caudal se utilizan para asegurar el tubo de traqueotomía; la sutura craneal se utiliza para proporcionar la tensión en la tráquea durante la colocación de traqueotomía. </li><li> Usando dos dedos, la sutura superior es agarrado y ligera tensión se aplica a la tráquea. Una incisión horizontal en la tráquea superior e inferior entre las suturas. Esta incisión debe cruzar aproximadamente dos tercios de la circunferencia traqueal. Un tubo de traqueotomía con pestaña (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diámetro exterior) se inserta en la tráquea distal y se fija en su lugar usando la sutura traqueal caudal. </li><li> La traqueostomía está conectado a un ventilador para animales volumen controlado pequeño (Inspira, Harvard Apparatus), y el ratón se ventila con 40% de oxígeno inspirado y 9 ml / kg volúmenes corrientes (ajustes optimizados para mantener una adecuada oxigenación / ventilación en nuestro laboratorio). Positiva presión espiratoria final (PEEP) no se comienza en este punto. Es de destacar que los parámetros del ventilador debe ser optimizado para las condiciones únicas dentro de cada laboratorio. Diferentes longitudes de tubo redundante (interpuesto entre el tubo del ventilador conector en Y y de traqueotomía) se puede utilizar para ajustar el espacio muerto, lo que garantiza la ventilación alveolar estable para cualquier volumen tidal elegido. </li></ol> 4. Cateterismo Venoso <ol><li> La unión de la vena yugular interna y externa pueden ser identificadas mediante el seguimiento de las ramas distales venosa proximal. La yugular externa se encuentra debajo de las glándulas salivales se refleja, lo que puede atribuirse proximalmente para encontrar el cruce yugular externa-interna. </li><li> Use disección roma suave para separar la unión yugular de tejido conectivo circundante. </li><li> Con suturas 4:0, ligar las venas yugulares externas yugular interna y distales (craneal) hasta el cruce yugular. </li><li> Haga una pequeña incisión en la carinade la unión yugular, sangrado debe ser mínimo. </li><li> Dos catéteres puede ser incrementalmente avanzar a través de la incisión y en el tronco yugular. Después de la aspiración suave para garantizar el retorno de sangre, catéteres se sujeta dentro de la vena mediante suturas 04:00. </li><li> Catéteres venosos cinta a la tabla de cortar para prevenir contra desplazamiento accidental. </li></ol> 5. Pulmón de ratones Microscopía intravital Cirugía (adaptado de Tabuchi et al. 18) <ol><li> El tablero de corte (que contiene el ratón contenida, anestesiados, así como grabadas catéteres venosos) es la transición a la etapa de microscopía intravital, donde las intervenciones quirúrgicas restantes se llevará a cabo. Una sonda de temperatura rectal se coloca; Esto se relaciona con un sistema de calefacción de adaptación (que se encuentra debajo de la tabla de corte), lo que permite el mantenimiento de euthermia ratón. </li><li> Un catéter venoso yugular está unido a una bomba de jeringa que proporciona una mezcla de cetamina (10 mg / ml)-xilazina (2 mg / ml)mezcla a 200 l por hora. Anestesia adecuada se confirma de nuevo usando la cola / pata pellizco. </li><li> La incisión de línea media se extiende desde el cuello hasta el apéndice xifoides, procediendo después lateralmente hacia el lado derecho (Figura 5). </li><li> Usando electrocauterización, la musculatura del pecho se retira, dejando al descubierto la caja torácica. Se tiene cuidado de asegurar la hemostasis completa. </li><li> Cruce pata trasera derecha del ratón sobre el lado izquierdo y cinta adhesiva. La torsión resultante abdominal gira ligeramente el tórax, la mejora de la facilidad de la cirugía. </li><li> Coloque el escenario en un ángulo de 45 grados (Figura 6), esta posición permite que el pulmón se apartarán de la pared del pecho una vez que el neumotórax es inducido. </li><li> La costilla st 1 (costilla más inferior) se sujeta con una pinza y se crió; unas pinzas curvas es empujado bruscamente por debajo de la costilla. Esto separa pleura parietal de la pared torácica. La pleura debe permanecer unpunctured. </li><li> Uso del tubo de soplado yuna jeringa, el aire es introducido a la fuerza en contra de la pleura parietal. Esto conduce a la ruptura de la superficie pleural y neumotórax sin dañar el pulmón subyacente. El pulmón subyacente caerá lejos de la pared del pecho, lo que permite la introducción de un fórceps de electrocauterización sin dañar el pulmón. Una disminución en el volumen tidal ventilador no se requiere típicamente durante este paso. </li><li> Usando una pinza electrocauterio, diseccionar la musculatura de la pared torácica y cortar a través de las 5 ª y 6 ª costillas / pleura parietal, lo que hace un ~ 8 mm agujero circular en la pared torácica. Es esencial que se mantenga una hemostasia completa, como la presencia de sangrado se oscurecen microscopía (Figura 7). </li><li> Utilizando el controlador de aguja, inserte el tubo de toracostomía en el agujero de la pared torácica. La aguja debe perforar la pared del pecho y salir de la cavidad torácica inferior y lateral a la ventana torácica (Figura 7). Tenga cuidado de no perforar el diafragma. Latubo entonces se tira suavemente de la pared del pecho hasta que ocurre la resistencia de la sutura &quot;tapón&quot; situado en el borde de la parte de orificios en el tubo. </li><li> Coloque la etapa plana. </li><li> Añadir 3 cm H 2 O de PEEP al ventilador para ayudar a ayudar reexpansión pulmonar. </li><li> Pegamento (Pattex gel, Henkel) se coloca circunferencialmente alrededor de la ventana de pecho. La membrana se une, con la hoja de la cubierta exterior de vidrio que da a la cavidad torácica. Cuidadosamente (y circunferencialmente) aproximada de la membrana para el pegamento mediante un aplicador de algodón. </li><li> Durante la realización de una maniobra de reclutamiento pulmonar (3 volúmenes de marea durante el cual el puerto de ventilador PEEP está tapada), -3 mm Hg de succión se aplica al tubo de pecho. El pulmón debe persistentemente se aproximan a la membrana mientras se mueven libremente durante la ventilación tidal (Figura 8). </li><li> La pata delantera derecha del ratón se cruzaron para el lado izquierdo, lo que resulta en una posición de decúbito lateral izquierdo del ratón.Cuñas de esponja puede utilizarse para colocar correctamente el ratón por lo que la ventana de pecho está alineado con el objetivo microscopía de inmersión en agua. </li><li> El agua destilada se coloca en la hoja de la cubierta antes de la microscopía, lo que permite la visualización del pulmón utilizando un objetivo de inmersión en agua. El agua tendrá que ser intermitente repone durante todo imágenes. </li></ol> 6. Medición de la pulmonar Espesor Capa superficial endotelial <ol><li> Inmediatamente después de cierre de la pared del pecho, 500 l marcado con FITC 150 kDa dextrano (6% solución en PBS) se administra a través del catéter venoso segundos (sin anestesia) yugular. Este bolo sirve como el volumen de reanimación, así como el marcador vascular para ESL medición. El bolo dextrano no influye en la adhesión de neutrófilos o la formación de edema pulmonar 2. </li><li> El objetivo de inmersión en agua está centrado sobre el cubreobjetos. La elección de los objetivos es esencial para visualizar las pequeñas diferencias en el grosor de ESL, un alto Numerical abertura que se necesita (&gt; 0,8), mientras que todavía mantiene un 2 a 3 mm de distancia de trabajo (que permite la penetración a través de la ventana de pulmón y la superficie pleural). Usamos la Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) y TPI 75 LWD 25x (NA 1.1) objetivos para este propósito. </li><li> Para medir con precisión espesor ESL en un órgano móvil, es esencial que los anchos de campo claro y fluorescencia vasculares se realizan simultáneamente. Esto se puede conseguir utilizando un divisor de la imagen (Dual View, Photometrics) que permite la captura simultánea de la luz reflejada de contraste de interferencia diferencial (DIC, claro) y las imágenes de FITC (Figura 9). </li><li> Durante una pausa de 5 segundos inspiratorio, continua de imágenes se lleva a cabo y se registra. Posteriormente, estas imágenes pueden ser revisados ​​para identificar en los cuadros de enfoque. </li><li> El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (&lt;20 m de diámetro) se identifican, al menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo marco. Después de la terminación del experimento, DICy FITC-dextrano anchuras vasculares se miden (por un observador ciego) promediando las longitudes de tres intercepta perpendiculares por los microvasos. Suponiendo igual espesor ESL en ambos bordes de la embarcación, el tamaño de ESL puede ser definida por la mitad de la diferencia entre la DIC y FITC-dextrano anchuras vasculares, como se describe en la sección de resultados representativos. </li><li> Típicamente, la microscopía intravital se puede realizar durante&gt; 90 min sin ninguna evidencia de lesión pulmonar o hipotensión 2. Los experimentos preliminares se realizaron para confirmar la estabilidad del ratón (presión arterial, la oxigenación, la ventilación, la lesión pulmonar) durante el período de observación. Los medicamentos experimentales pueden ser introducidos a través del segundo catéter (no anestesia) yugular en cualquier momento durante el procedimiento. </li></ol> 7. La medición alternativa de la integridad del endotelio pulmonar capa superficial Las funciones endoteliales intactas capa superficial (en parte) para excluir circulanteción elementos de la superficie endotelial 2. Integridad ESL por lo tanto se puede medir por la capacidad de un elemento de circulación (por ejemplo, una microesfera fluorescente) para acceder e interactuar con moléculas de adhesión (tales como ICAM-1). <ol><li> Anti-ICAM-1 marcado con microesferas fluorescentes se preparan antes de la cirugía. Recubiertas de estreptavidina 0,97 micras microesferas fluorescentes son incubadas con biotina de control de anti-ICAM-1 (clon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) o isotipo de anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las microesferas se lavaron tres veces y se suspendieron en PBS a 1 x 10 9 microesferas por ml. </li><li> Durante microscopía intravital, la suspensión de microesferas (100 l) se inyecta en el catéter venoso yugular. Después de 15 min de circulación, imágenes fluorescentes se capturaron más de 5 min. Inmóvil durante&gt; 5 min microesferas se considera adherente y se cuantificó usando software de procesamiento de imágenes. </li></ol> 8. Eutanasia &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Después de la finalización del procedimiento, los ratones anestesiados son sacrificados por desangrado mediante punción cardiaca directa. La eutanasia se confirmó a través de neumotórax bilateral, después de lo cual los pulmones se cosechan y se congelaron rápidamente para su posterior análisis.

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No hay conflictos de interés declarado.

Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco. Varios avances...

El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante. Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento 6. El creciente uso de la microscopía intravital 7 (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC 8 y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas 9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano 10, 11). De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la &quot;invisible&quot; ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de 2 vasculares. El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo 12, 13, existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización 14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos 15 y lesión pulmonar 16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada &quot;atelectrauma&quot;), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar 17. En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento 18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nombre de Reactivo </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Recubiertas de estreptavidina microesferas fluorescentes </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragón verde fluorescente (similar a FITC) </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 anticuerpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> Clonar YN1/1.7.4 </td><td> Dilución 1:50 </td></tr><tr><td> Isotipo de anticuerpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> Dilución 1:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Ventilador mecánico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Traqueostomía catéter </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Aparato de electrocauterización </td><td> DRE Medical </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Cauterio bipolar fórceps </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200i </td><td> 9.9cm McPherson </td></tr><tr><td> Temperatura control sistema </td><td> World Precision Instruments </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de jeringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Bomba Elite 11 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (campo amplio) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio (confocal) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Imagen divisor </td><td> Fotometría </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD cámara </td><td> Fotometría </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Software de procesamiento de imagen </td><td> Nikon </td><td> Elementos NIS </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de polivinilideno </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos circular </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, # 1 espesor </td></tr><tr><td> Pegamento (cover slip a la membrana) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (líquido) </td><td> Para fijar cubreobjetos a la membrana </td></tr><tr><td> Pegamento (cubierta deslizante para el ratón) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Para la fijación de la membrana de ratón </td></tr><tr><td> Tubo quirúrgico </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Pescador </td><td></td><td> Seda 04:00 </td></tr><tr><td> Rasuradora eléctrica </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Curvados fórceps quirúrgico </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Straight pinzas quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro tijeras quirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Conductor aguja quirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cinta quirúrgica </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esponjas de cocina (cortado en trozos) </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.

El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (&lt;20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análi...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo<em&gt; In vivo</em&gt; Pulmón de ratón.

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K vistas.  University of Colorado School of Medicine. El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo In vivo Pulmón de ratón.

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Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Investigación

Medicina

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Medición Automatizada de la microcirculación de la sangre Velocidad del caudal en metástasis pulmonar de ratas

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetría intrauterina para medir la presión del ratón contráctil<em&gt; En Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

El uso de la tomografía computarizada-Micro para la evaluación del desarrollo del tumor y Seguimiento de la respuesta al tratamiento en un modelo de ratón de cáncer de pulmón

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ultimately lead to new knowledge concerning the causes of or new ways to inhibit or treat plasma extravasation. It is important that researchers have the proper tools, including the best methods available, for studying plasma extravasation. In this article, we describe a protocol, using the Evans blue dye method, for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice. This protocol is intentionally simple, to as great a degree as possible, but provides high quality data. Evans blue dye has been chosen primarily because it is easy for the average laboratory to use. We have used this protocol to provide evidence and support for the hypothesis that the enzyme neprilysin may protect the vasculature against plasma extravasation. However, this protocol may be experimentally used and easily adapted for use in other strains of mice or in other species, in many different organs or tissues, for studies which may involve other factors that are important in understanding, preventing, or treating plasma extravasation. This protocol has been extensively optimized and modified from existing protocols, and combines reliability, ease of use, economy, and general availability of materials and equipment, making this protocol superior for the average laboratory to use in quantifying plasma extravasation from organs.

In this article, an economical, optimized, and simple protocol is described which uses the Evans blue dye method for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice that can be adapted for use in other strains, species, and other organs or tissues.

Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of group 2 PH, due to mitral stenosis (MS), to facilitate the investigation of disease mechanisms and potential therapeutic strategies. We present a novel rat model of pulmonary venous congestion-induced pulmonary venous arterialization and group 2 PH caused by left atrial stenosis (LAS). LAS is achieved by constricting the left atrium using a half-closed titanium clip. After the LAS surgery, a rat model with a transmitral inflow velocity greater than or equal to 2.0 m/s on echocardiography gradually develops pulmonary venous arterialization and group 2 PH over an 8- to 10-week period. In this protocol, we provide the step-by-step procedure of how to perform the LAS surgery. The presented LAS rat model mimics MS in humans and is useful for studying the underlying molecular mechanism of pulmonary venous arterialization and for the preclinical evaluation of therapies for group 2 PH.

Left atrial stenosis (LAS) is a novel surgical technique used for studying group 2 pulmonary hypertension (PH) and mechanisms underlying pulmonary venous arterialization. Here, we present a protocol to constrict the left atrium using a titanium clip to cause pulmonary venous arterialization and moderate PH in a rat.

Estenosis Atrial izquierda inducido arterialización venosa pulmonar y el grupo 2 la hipertensión pulmonar en rata

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of ...