Wir danken Gillian Stanfield für Kommentare zum Manuskript. TAJ wird von der University of Utah Genetics Ausbildungsförderung T32-GM007464 von NIH NIGMS unterstützt.

1. Mosaic-Generation <ol><li> Genetische Kreuz w FRT 19A Badewanne: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (Männchen) X * FRT 19A / Bal (Frauen), wobei * für die Mutante untersucht werden. Hinweis: Richten Sie überqueren mindestens einen Tag vor dem Experiment, da dies ermöglicht Tiere angemessen zu paaren. </li><li> Pre-lay: Transfer Kreuz zu fliegen-Food-Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste auf den Medien platziert. Man lässt 1 Stunde bei 25 ° C lag </li><li> Lay: Transfer von Tieren vor der Verlegung in ein frisches Fläschchen Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste. Lassen Sie für 6 Stunden bei 25 ° C lag </li><li> Übertragen Erwachsenen zurück vor, lag Fläschchen für die Lagerung und den Einsatz in nachfolgenden Experimenten. Unmittelbar Hitzeschock die Laien Fläschchen mit 0-6 Stunden alte Embryonen für 45 min bei 38 ° C, in einem zirkulierenden Wasserbad. Hinweis: Die Oberfläche des Lebensmittels sollte unterhalb des Wasserspiegels, alle zu überprüfenEmbryonen werden entsprechend erwärmen schockiert. </li><li> Inkubieren wärmegeschockt Fläschchen bei 25 ° C für 4-5 Tage bis zum dritten Larvenstadium beginnen zu wandern. </li></ol> 2. Schirm für Mosaic Tiere <ol><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig holen wandernden dritten Larvenstadium von den Seiten des Fläschchens und legen Sie sie in ein gekühltes 100% Glycerin in einem kleinen Kunststoff-Platte. </li><li> Untersuchen Larven mit einer hohen Vergrößerung-Binokular mit fluoreszierenden Optik ausgestattet. Identifizieren Larven mit Mosaik-Expression von fluoreszenzmarkierten trachealen Zellen. Typischerweise kann dies in 10-20-facher Vergrößerung durchgeführt werden. </li></ol> 3. Wärmefixierung <ol><li> Mit feinen Pinzette sorgfältig auswählen Mosaik Tiere aus der Schale und in einem Tropfen frisch 100% Glycerin auf einem 75x25x1 mm Weißglas Objektträger. Hinweis: mehrere Tiere können in der Dropdown (Abbildung 1A) platziert werden. Tiere können auch in einem Tropfen Glycerin direkt auf einem Deckglas platziert werden,aber es muss während der Fixierung (Schritt 3.2) genommen werden, da die Tiere sehr schnell erwärmen wird und kann sich über-fixed. </li><li> Platz Glasträger auf 70 ° C Heizblock bis die Tiere einfach nicht mehr bewegen, nicht mehr als 20 Sekunden für eine Folie, und 10 sec für ein Deckglas (Abbildung 1B). Tiere zappeln zunächst aber stoppen und steif und längliche einmal tot ist. Hinweis: überlange Wärmeeinwirkung wird Endästen und Lumen sowie um das GFP-Signal schwach und diffus beschädigen. Für eine optimale Effizienz empfiehlt es sich, um die Wärme-Block im selben Raum wie die Mikroskope haben. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig orientieren alle Larven im Drop in eine einzige Richtung, so dass alle Larven auf der Folie parallel zueinander (Fig. 1c). </li><li> Sanft legen eine micro 18x18mm Deckglas auf der Oberseite der Larven (oder invertieren das Deckglas auf einen Glasträger) und Bildung von Blasen zu vermeiden (Abbildung 1D). Hinweis: Deckglas kann nicht genau liegenflach über Larven, ist dies kein Problem. </li><li> Bild Larven innerhalb von 30 min. Wärme Festanschlusses Zellen abgebaut wird und GFP-Signal wird sehr diffus. </li></ol> 4. In vivo Imaging von Tracheal Terminal-Cells <ol><li> Legen Sie gleiten auf der Bühne einer Verbindung Stereomikroskop. Mit einem Ziel 5X lokalisieren die beiden parallelen Leitungen ausgeführt dorsal von anterior auf der dorsalen Fläche des Tieres (1F) posterior. Suchen Sie die beiden dorsalen Terminal Zellen, direkt zwischen den beiden dorsalen Stämme. Dies hilft bei der Identifizierung der entsprechenden Segment für die Analyse. </li><li> Einmal ausgerichtet, drehen die Tiere Bild gewünschte Terminal Zellen. Um dies zu tun, sorgfältig schieben das Deckglas auf dem Rand mit der Zange senkrecht zur Längsachse der Larven, langsam rollen die Larven unter dem Deckglas (1E und 1G). </li><li> Die Auswahl der richtigen Terminal Zellen ist entscheidend für konsistente Ergebnisseund Vergleiche zwischen den Mutanten. Die Fettkörper Zweig (FB) Terminalzellen sind leicht zu finden neben dem dorsalen Stamm, lateral der Mittellinie. Die seitlichen Gruppe G Terminal Zellen (LG) sind leicht zu finden und befindet sich nur lateral der ventralen Mittellinie (Abbildung 1H). Hinweis: in den vorderen (Tr1) und posterioren (Tr10) die Anordnung der Segmente Terminal Zelle ist abweichend von anderen Segmenten. Wir analysieren nur Terminal Zellen in Segmente Tr2-Tr9. Dorsal Terminal Zellen haben eine stereotype Verzweigungsmuster als andere tracheal Terminal Zellen. Dies kann auf zusätzliche, nicht-Zell-autonome Signale ab, und dies sollte bei der Entscheidung, ob sie in der Analyse erweitert werden. </li><li> Sobald ein Terminal Zelle von Interesse identifiziert worden ist, ein Bild aufzunehmen mit der gewünschten Vergrößerung; typischerweise 10X oder 20X besten ist (Abbildung 2A). Hinweis: Aufgrund der variablen Verzweigung Muster, versuchen Sie, so viele Bilder, die Äste und Zweigspitzen wie möglich zu erfassen sind. </li><li> Ohne sich zu bewegen auf die Bühne, schalten Sie die Fluoreszenz und schalten Sie den Durchlicht Hellfeld, ein Bild von der gleichen Zelle und Bildebene (2B) zu erfassen. Das Lumen wird man sich als dunkel abgesetzte innerhalb des Terminals Zellraum. Wenn die Planung auf quantifizieren Endzelle Filialen und Lumen, sammeln mehrere Bilder in verschiedenen Fokusebenen jedem Endgerät Zelle. </li></ol> 5. Analyse und Quantifizierung des Terminal Zellmorphologie mit ImageJ <ol><li> Öffnen Sie die Leuchtstoff-und Hellfeld Bilder mit dem ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) Plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Mit dem &quot;Add-Kurs&quot; Werkzeug manuell verfolgen die Zweige und das Lumen des gesamten Terminal Zelle. </li><li> Mit dem &quot;Label-Kurven&quot;-Werkzeug, umbenennen und recolor um jede Zeile in der Spur eine spezifische Bezeichnung zuordnen. </li><li> Mit dem &quot;Set Parameter&quot;-Werkzeug, stellen Sie die Linienbreite 6-10 Pixel (für 512x512 Bilder von der Digitalkamera mit dem zusammengesetzten Mikroskop erhalten. Für höhere oder niedrigere Auflösung Kameras, die Pixel-Breite sollte entsprechend skaliert werden), mit allen anderen Standardeinstellungen, und wählen Sie &quot;OK&quot;. Dann nutzen Sie die &quot;Make Momentaufnahme&quot; Werkzeug, um ein Bild aufzunehmen. Wählen Sie &quot;Zeichnen Spur&quot;, um eine Momentaufnahme der Spur, die Side-by-side gezeigt kann mit dem originalen werden erhalten. </li><li> Wählen Sie das &quot;Measure Kurven&quot;-Werkzeug und wählen Sie das Tracing-Typ (dh, die Zweige zu messen über die spezifischen Bezeichnungen in Schritt 5.3 zugewiesen basierend). Als nächstes wählen Sie &quot;Display Tracing Messungen&quot; und &quot;Clear früheren Messungen&quot;, dann auf &quot;Ausführen&quot;. Dies erzeugt eine Tabelle, die den Namen, Label, Länge (in Pixeln) und andere Daten für das Bild enthält. Diese Daten können dann als Microsoft Excel-Tabelle zur weiteren statistischen gespeichert werdenAnalyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanzielles Interesse haben.

Die Wärmefixierung hier beschriebene Technik ist eine schnelle und bequemes Werkzeug für Imaging Drosophila Larven tracheal Terminal Zellen. Hier verwenden wir diese Technik, um die Verzweigung und Lumen Muster von Wildtyp-Zellen zu untersuchen. Tracheal-Zellen, die GFP durch die Luftröhre Promotor atemlos angetrieben, können leicht sichtbar durch die Larvencuticula nach Wärmefixierung. Die spezifischen Verzweigungsmustern einzelnen Terminal-Zellen, sowie die von den mit Luft gefüllten Hohlraum, ...

Zellform ist entscheidend für die Funktion der einzelnen Zellen in einem Organismus, sowie Zellen, die als Teil eines Gewebes oder Organs. Wir verwenden Drosophila tracheal Terminal-Zellen, eine Komponente des Insekts Atmungsorgane, um die molekularen Mechanismen, die bei der Kontrolle zwei konservierte Arten von zellulären Morphologie teilnehmen zu untersuchen: Verzweigung und tube formation (lumenogenesis). Terminal-Zellen an den Spitzen eines Netzes von verzweigten Rohren angeordnet ist, daß Funktionen, um Sauerstoff zu inneren Gewebe 1 zu liefern und eine aufwendige verzweigten Morphologie, die auf einer FGF Signalweg, der durch lokale Sauerstoffgehalt im Zielgewebe 2 gesteuert abhängt. Terminal-Zelle Zweige sind dünne Röhren, mit einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden Zweig. Die unterschiedlichen zellulären Architekturen Terminal Zellen zusammen mit der Leichtigkeit, mit der genetischen Analyse in Drosophila durchgeführt werden kann, um diese Zellen ein ausgezeichnetes Modell foder die Untersuchung der zellulären Mechanismen Auswuchs, Verzweigung und intrazellulären tube formation. Terminal-Zellen haben ein nützliches Modell für das Verständnis einige der Signalwege, die zu verzweigten Zelldifferenzierung, Auswuchs und Reifung 2-4 bewiesen. Mit diesem System unvoreingenommene, haben uns genetischen Screens für Zellmorphogenese Mutanten durchgeführt, wodurch Einblicke in Mechanismen, die Zellform 5,6. Zum Beispiel haben diese Bildschirme enthüllt, dass ein bestimmtes RabGAP für Zytoskelett Polarität und Vesikeltransport in Lumenbildung und Positionierung 7 erforderlich ist; dass Integrin-vermittelte Adhäsion für Zweig Stabilität 8 gefordert wird, und dass die epithelialen PAR-Proteine ​​regulieren Polarität polarisierter Membran Menschenhandel erforderlich sowohl für Verzweigung und Lumenbildung 9. Andere Studien in Terminal Zellen haben gezeigt, dass asymmetrische Aktin Akkumulation und Organisation der Mikrotubuli für die Zell-Dehnung und lumenogenesis erforderlich <sbis&gt; 10. So tragen diverse, konservierten zellbiologischen Mechanismen der Klemme Zellmorphogenese. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um schnell beheben intakt dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zur Analyse der Endzelle Verzweigung und Lumenbildung. Dieses Protokoll kann auch auf beide ersten und zweiten Larvenstadium Tieren durchgeführt. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Fähigkeit, Zellen, die gentechnisch Terminal durch fluoreszierende Protein-Expression direkt durch die Larvencuticula von intakten Tieren gekennzeichnet visualisieren. Da dieses Verfahren benötigt keine Postfixierung Manipulationen, wie z. B. Antikörper-Färbung, um die Zellen zu beobachten, ist es gut für das Hochdurchsatz-Analyse geeignet, einschließlich genetischer oder Wirkstoff-Screening. Fluorescent Protein-Expression zeigt die Struktur der zytoplasmatisch gefüllten Ästen. Rohr-Bildung kann in parallel mit Hellfeld den gasgefüllten Lumen, die mit der umgebenden Flüssigkeit zu füllen kontrastiert identifizieren überwacht werdened Gewebe. Inbegriffen in diesem Protokoll ist das Verfahren zur Erzeugung von genetischen Mosaiken an der MARCM System 11, um homozygote Mutante Terminal Zellen mit fluoreszierenden Proteinen in ansonsten unmarkierten Tieren markierten Produkten. Dies ist notwendig, da nur Zellen Terminal erarbeiten ihren komplexen Strukturen relativ spät in der Entwicklung; genetischen Mosaiken ermöglichen Bypass Gen Anforderungen in anderen Geweben früher in der Entwicklung. . Um MARCM Klone erzeugen, Luftröhre sind beschriftet mit der Tracheal-spezifische Treiber atemlos (BTL) 12 Beschrieben ist hier das Protokoll für die Drosophila X-Chromosom, bei anderen Chromosomen, ein ähnliches Verfahren verwendet, mit genetischen Reagenzien werden, die dem Chromosom ist untersucht. Hier werden Luftröhre durch Expression einer cytoplasmatisch lokalisierten GFP-markierten, aber das Verfahren funktioniert genauso gut mit der Expression anderer fluoreszierende Proteine ​​wie DsRed. Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Verzweigung Muster und Lumenbildung im Terminal Zellen quantifiziert, basierend auf Methoden zur Charakterisierung neuronalen Verzweigungsmustern 13 entwickelt enthalten. Diese Art von quantitativen Daten kann kritisch sein in der anspruchsvollen genaue Rolle von Genen bei der Verzweigung oder lumenogenesis Prozess, sowie die Möglichkeit für direkte Vergleiche zwischen verschiedenen Mutanten 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

Zellform ist entscheidend für die Zellfunktion. Doch trotz der Bedeutung der Morphologie der Zellen, ist wenig darüber, wie einzelne Zellen erzeugen spezifische Formen bekannt. Drosophila tracheal Terminal Zellen haben sich zu einem mächtigen genetisches Modell zu identifizieren und erläutern die Rolle von Genen benötigt zur Erzeugung von zellulären Morphologie. Terminal-Zellen sind eine Komponente eines verzweigten röhrenförmigen Netzes, die Tracheen, dass Sauerstoff zu liefern inneren Geweben dient. Terminal-Zellen sind ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Fragen der Zelle Form, wie sie zwei unterschiedliche zelluläre Architekturen besitzen. Zuerst müssen Klemme Zellen eine aufwendige verzweigten Morphologie ähnlich komplexen Neuronen, zweitens Endzelle Zweige als dünne Rohre ausgebildet und enthalten eine membrangebundene intrazellulären Lumen. Quantitative Analyse von Zell-Terminal Zweig-Nummer, Branchenverband und einzelne Zweig Form kann verwendet werden, um Informationen über die Rolle von spezifischen genetischen mech liefernnismen in der Herstellung eines verzweigten Zelle. Analyse tube formation in diesen Zellen zeigen konservierten Mechanismen Tubulogenese gemeinsam mit anderen rohrförmigen Netzwerke wie das Wirbeltier Gefäßsystem. Wir beschreiben Techniken, die verwendet werden, um schnell zu beheben, Bild werden kann und zu analysieren und sowohl Verzweigungsmustern tube formation in Terminal Zellen in Drosophila-Larven. Diese Techniken können verwendet werden, um Zellen Terminal in Wildtyp-und mutierten Tiere, oder genetische Mosaike zu analysieren. Aufgrund der hohen Effizienz des Protokolls ist es auch gut für genetische, RNAi-oder Drogen-Bildschirme in der Drosophila Tracheensystem geeignet.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Eine einzelne seitliche Gruppe (LG) Endzelle umfaßende subzellulären Verzweigung (visualisiert GFP, A) und einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden der Zweige (visualisiert Hellfeld; B). Diese Bilder wurden von einem Mosaik L3 Larve gesammelt, unter Verwendung der MARCM System in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben, und Wärme fixiert und abgebildet wird, wie in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben. Panels C &amp; D zeigen eine NeuronJ er...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Hier präsentieren wir eine Methode für die Lichtmikroskopie Analyse der Luftröhre Terminal Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Prüfung der Branche und Lumen Morphologie in ganzen Tieren und wäre nützlich für die Analyse der einzelnen Mutanten oder Bildschirme für Mutationen, die Terminal-Zell-Entwicklung.

Prüfung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Tracheal Terminal-Cells durch Lichtmikroskopie

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K Aufrufe.  University of Utah. Hier präsentieren wir eine Methode für die Lichtmikroskopie Analyse der Luftröhre Terminal Zellen in Drosophila Larven. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Prüfung der Branche und Lumen Morphologie in ganzen Tieren und wäre nützlich für die Analyse der einzelnen Mutanten oder Bildschirme für Mutationen, die Terminal-Zell-Entwicklung.

Serie: Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Präsynaptisch Stille Synapsen mit Lichtmikroskopie Studium

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...