Wir danken Dr. Toshio Terashima der Universität Kobe, Japan, für die Lehre des Kehlkopfoperationstechnik und Dr. Lynn Enquist von der Princeton University für die Versorgung PRV-Bartha. Forschung wurde von NIH Pioneer Award DP1 OD000448 Erich D. Jarvis und ein NSF Graduate Research Fellowship Award an Gustavo Arriaga unterstützt. Zahlen entsprechend gutgeschrieben früheren Arbeiten werden unter der PLoS ONE offenen Zugang Creative Commons-Lizenz (CC-BY) gemäß redaktionelle Politik der Zeitschrift verwendet.

HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden überprüft und von der Duke University Institutional Animal Care &amp; Use Committee genehmigt. 1. Speichern Pseudorabiesvirus <ol><li> Wir erhalten Lebendvirus (PRV152) aus dem Labor von Dr. Lynn Enquist an der Princeton University mit einem Titer von 1 × 10 9 pfu / m. Das Protokoll, das Virus zu erzeugen, ist veröffentlicht worden 2. </li><li> Aliquot des Virus bei 20 &amp; mgr; l pro Röhrchen in einem BSL-2 Biosicherheitswerkbank und bei -80 ° C unter angemessenen Biosicherheitsbedingungen. </li><li> Tauwetter ein Aliquot PRV unmittelbar vor der Injektion. </li></ol> 2. Chirurgische Vorbereitung für Injektionen in den Muskel <ol><li> Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran. </li><li> Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe. </li><li> Bereiten ter Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion des Operationsstelle mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen). Achten Sie darauf, sterilen Tüchern zu verwenden, um chirurgische Bereiche abdecken. Achten Sie darauf, um sterile Techniken in den Verfahren einzuhalten. </li><li> Machen Sie einen Hautschnitt und zeigen die Muskeln von Interesse. Zum Beispiel, um den Kehlkopf cricothyroideum Muskel Zugriff ist es erforderlich, zunächst die darüberliegende Teil des M. sternohyoideus entfernen. </li><li> Verschließen Sie alle durchtrennten Muskeln mit Vetbond Gewebekleber. </li></ol> 3. Injektion von PRV in Muscle <ol><li> Laden Sie die 10 &amp; mgr; NanoFil Mikrosystem mit frisch aufgetauten PRV-Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät. </li><li> Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung tritt aus der Mikrospitze. Entsorgen Flüssigkeit als bioharzard Abfälle. </li><li> Unter Verwendung eines stereotaktischen microPositionierung Gerät stellen sorgfältig die Mikrospitze in den Muskel von Interesse und langsam füllen die Muskeln bis leichte Schwellung sichtbar ist. Die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe des Muskels und das Volumen zu variieren, um injiziert werden. So sollte beispielsweise fünf Injektionen von 200 nl (1 ul insgesamt) bei einer Rate von 4 nl / sec 1 min auseinander am gleichen Ort, um die cricothyroideus füllen. Bewegen Sie die Spritze in die nächste Muskel von Interesse (die seitliche cricoarytenoideus in diesem Fall) und wiederholen Sie den Einspritzvorgang. Jeden Muskel nur einmal zu durchstechen. </li><li> Ziehen Sie die Mikrospritze nach fünf Minuten. </li><li> Verschließen Sie den Bruch in der Faszie mit Vetbond Gewebekleber. </li><li> Nachdem alle Injektionen abgeschlossen sind, schließen Sie die Wunde mit Vetbond Gewebekleber. Abhängig von Ihrer lokalen institional Tiernutzung Richtlinien, Nähten oder Wundklammern verwendet werden. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, durch y erforderlichunsere institutionellen Tiernutzung Richtlinien. </li><li> Nach dem experimentell ermittelten Überlebenszeit (in diesem Fall 90 h bis zu markieren 2. Ordnung kortikalen Neuronen), opfert das Tier Pentobarbitalüberdosis und transkardial perfundiert mit 0,9% Salzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS. </li><li> Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden. </li><li> Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std. </li></ol> 4. immunchemischen Nachweis von eGFP <ol><li> Zuschnitte bei 40 &amp; mgr; m auf einem Schlittenmikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS. Dünneren Abschnitten, beispielsweise 30 &amp; mgr; m kann beim Beizen Einbaufelder verwendet werden. </li><li> Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt. </li><li> Blockieren nicht-spezifischer Antigene in den Abschnitten für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Ziegenserum vom VECTASTAIN Elite Kit (VE-Kit). </li><li&gt; Inkubation blockiert Abschnitte für 3,5 Stunden in Kaninchen-anti-eGFP (1: 1.000) bei RT. </li><li> Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann inkubiert sie für 1 Stunde in Ziegen-Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers von dem VE Kit bei RT. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal in PBS waschen Abschnitte für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung von der VE Kit bei RT. </li><li> Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) und 0,015% H 2 O 2. </li><li> Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten). </li><li> Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium. </li><li> Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop. Die DAB Reaktionsprodukt inside die Zellen sollten braun erscheinen. Digitalisierte Bilder können Farben umgekehrt, um feine Prozesse hervorzuheben ist. </li></ol> 5. Chirurgische Vorbereitung für die Injektion von Tracern in Hirnregionen Entdeckt von PRV Tracing <ol><li> Induzieren Narkose durch intramuskuläre Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg Ketamin, 10 mg / kg Xylazin) und Aufrechterhaltung eines geeigneten Anästhetikums Ebene mit Isofluran. </li><li> Schützen die Hornhaut mit einer ophthalmischen Salbe. </li><li> Befestigen Sie den Kopf in einem geeigneten stereotaktischen Rahmen. </li><li> Bereiten Sie die Operationsstelle nach aseptischen Bedingungen durch Trimmen Haare und Desinfektion der Website mit alternierenden Peelings von Betadine und 70% Alkohol (mindestens 3 Zyklen). </li><li> Machen Sie einen Kopfhauteinschnitt und Einfahren der Haut über der Hirnregion von Interesse. </li><li> Führen Sie eine kleine Kraniotomie bei den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten. Zum Beispiel werden die Koordinaten für laryngeally verbunden motorischen Kortex von PRV-Tracing in einer identifiziertenn erwachsenen Maus sind 1,2 mm lateral und 0,2 mm rostral Bregma. </li></ol> 6. Die Injektion von biotinylierten Dextran Amine in Gehirn- <ol><li> Bereiten Sie 7,5% biotinylierten Dextran Amine (BDA) durch Lösen von 25 mg des BDA (10.000 MW) in 333 ul steriler Kochsalzlösung. </li><li> Laden Sie die Mikropipette System Nanoject II mit ausreichender BDA-Lösung für die geplanten Injektionen. </li><li> Langsam löschen Sie den toten Raum und prüfen, ob Lösung Verlassen der Mikropipettenspitze. </li><li> Unter Verwendung eines stereotaktischen Mikropositionierung Gerät vorsichtig niedriger die Mikropipettenspitze in das Gehirn Region von Interesse und langsam injizieren BDA. Stellen Sie die Einspritzrate in Abhängigkeit von der Größe der Region, um zu kennzeichnen. Zum Beispiel sollten 12 Injektionen von 4,6 NL hat an vier verschiedenen Standorten 0,2 mm auseinander (rostro-kaudal), um die laryngeally verbunden motorischen Kortex in erwachsenen Mäusen zu decken. Das endgültige Injektionsvolumen sollte entsprechend der Größe der Hirnregion von Interesse angepasst werden, Wenn man bedenkt, dass Etikett kann aus der Spritzkern durch Diffusion durch Hirngewebe und entlang den Prozessen der markierten Neuronen ausgebreitet. </li><li> Verschließen Sie die Kraniotomie mit Zahnzement, und schließen Sie die Kopfhaut Wunde mit Vetbond Gewebekleber. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich. </li></ol> 7. Die Injektion von Cholera Toxin-Untereinheit b in Muscle <ol><li> Vorbereitung 1% Cholera Toxin-Untereinheit B (CTB), die durch Auflösen von 1 mg CTb in 100 ul steriler Kochsalzlösung. </li><li> Sechs Tage nach BDA Injektion in das Gehirn, führen die chirurgische Vorbereitung wie oben für PRV Injektionen beschrieben in den Muskel. </li><li> Laden Sie die 10 &amp; mgr; NanoFil Mikrosystem mit CTb Lösung, fügen Sie eine 34 G Nadel aus rostfreiem Stahl, und sorgfältig montieren Sie ihn auf der stereotaktischen Gerät. </li><li> Führen die Mikroinjektion in den Muskel (n) von Interesse, wie vorstehend dePRV beschrieben. </li><li> Überwachen Sie das Tier bis zum Brustlage und bieten Analgesie, Nahrung, Wasser, und die Fürsorge, die von Ihrem institutionellen Tiernutzung Richtlinien erforderlich. </li><li> Drei Tage nach CTb Injektion, zu opfern das Tier durch Überdosis Pentobarbital und perfundieren transkardial mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Formaldehyd in 0,1 M PBS. </li><li> Entfernen und nach der Fixierung des Gehirns in 4% Formaldehyd für 24 Stunden. </li><li> Cryoprotect das Gehirn in Phosphatpuffer, enthaltend 30% Sucrose für mindestens 48 Std. </li></ol> 8. Nachweis der BDA und CTB in dieselben Abschnitte <ol><li> Zuschnitte bei 40 &amp; mgr; m auf einem Mikrotom und speichern schwebenden Abschnitte, in 0,1 M PBS. </li><li> Stillen Abschnitte für 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS vor Licht geschützt. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 1 Stunde in ABC-Lösung bei RT. </li&gt; <li> Dreimal waschen Abschnitte in Phosphatpuffer für 10 min, und zu entwickeln, für 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin), 0,015% H 2 O 2 und 0,05% Nickelchlorid. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte erscheinen schwarz. </li><li> Blockabschnitte für 30 min in PBS mit 0,3% Tween 20 mit normalem Kaninchenserum aus dem VECTASTAIN Elite Kit. </li><li> Inkubieren blockiert Abschnitten 2 h in Ziegen-Anti-CTb (1: 10.000) bei RT. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min und dann inkubiert sie für 1 h in Kaninchen-anti-Ziege-sekundärem Antikörper von dem VE Kit bei RT. </li><li> Vorbereitung der ABC-Lösung von der VE-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Dreimal waschen Schnitte in PBS für 5 min, dann reagieren sie für 30 min in ABC-Lösung bei RT. </li><li> Dreimal in Phosphatpuffer gewaschen Schnitte für 10 min, und die Entwicklung bis zu 8 min in Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) und 0,015% H 2 O 2. Die DAB Reaktionsprodukt innerhalb der Zellen sollte braun erscheinen. </li><li> Montageabschnitte auf Superfrost Plus Rutschen und entwässern sie durch eine abgestufte Alkoholserie (70%, 95%, 100% und 100% für jeweils 5 Minuten). </li><li> Deaktivieren Sie die Schnitte durch zwei Wäschen Xylol (5 min jeweils) und Deckglas die Folien mit Permount Eindeckmedium. </li><li> Bild die montierten Teile auf einem Mikroskop. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Es gibt eine Reihe von Fragen, die berücksichtigt bei der Planung eines Experiments unter Verwendung PRV152 4,21 getroffen werden müssen. Am wichtigsten ist, Pseudorabies-Virus tödlich. Wie zuvor erwähnt, Menschenaffen, einschließlich Menschen, sind nicht anfällig für Infektionen, sondern müssen entsprechende Sorgfalt auf andere Tiere zu schützen. Erwachsene Mäuse überleben in der Regel fünf bis sieben Tage nach der Impfung mit attenuierten PRV152 Belastung. Daher ist PRV152 nicht für Experimente...

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn von Nagetieren durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV), vor allem die abgeschwächten Stamm PRV-Bartha erstmals 1961 beschrieben, verwendet 12. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Identifizierung der Motor kortikalen Repräsentation von spezifischen Muskeln oder Muskelgruppen unter Verwendung eines rekombinanten Pseudorabies-Virus-Stamm (PRV152) die verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP) Reporter-Gen 2 zum Ausdruck. Das beschriebene Verfahren nutzt das Verhalten der neurotropen Viren, die infektiösen Nachkommen, dass grenz Synapsen zu anderen Neuronen innerhalb einer Funktionsschaltung 3,4,13 infizieren zu produzieren. PRV152, die isogen mit PRV-Bartha ist, kreuzt nur Synapsen retrograd durch die hierarchische Reihenfolge der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 3,5 &lt;/ sup&gt;. Durch präzises Steuern der peripheren Stelle der Infektion ist es möglich, den Eintritt des Virus in das Gehirn durch eine spezifische Untergruppe von Motoneuronen zu begrenzen. Da das Virus infiziert Ketten sequentiell verbundenen Neuronen, wird das sich ergebende Muster eGFP Signal gesamten Gehirn dann lösen das Netzwerk von Neuronen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von Virus für neuronale Verfolgung ist die Amplifikation des Reporter-Protein (eGFP in diesem Fall) in infizierten Zellen. Diese Signalverstärkung bietet ein Maß an Sensibilität, die Detektion auch spärlich Projektionen ermöglicht. Zum Beispiel wurde eine spärliche Projektion aus vibrissa motorischen Cortex zu den Gesichtsmotoneuronen Steuern der Whisker in Ratten unter Verwendung viral exprimierten green fluorescent protein 14 gefunden; früheren Studien konnte diesen Vorsprung mit klassischen Tracern ohne Reporter-Gen-Amplifikation 11,15 zu finden. leiderViele virale Verfolgung Vektoren, wie das in der zitierten Studie verwendeten nicht kreuzen Synapsen, wodurch ihre Verwendung für die Rückverfolgung Mehrsynapsenschaltungen einschränkend. Während der Präsentation deutliche Vorteile für die Identifizierung der Netzwerk von Zellen, die an einem Motorstromkreis, der verteilten Natur transsynaptische Tracing mit PRV-152 macht die Interpretation von spezifischen Verbindungen innerhalb der Schaltung schwierig. Daher präsentieren wir ein einfaches Verfahren für die Validierung von spezifischen Verbindungen innerhalb Schaltungen identifiziert mit PRV-152 durch Doppelklick Etikettierung unter Verwendung von biotinylierten Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Der kombinierte Einsatz von BDA und CTB ist ein etablierter Ansatz zur Verfolgung Verbindungen zwischen bestimmten Gruppen von Neuronen 6-8,11. Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese beiden Tracer in demselben Abschnitt unter Verwendung eines Zweifarben DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) Prozedur 16 visualisiert werden. Hochmolekulare BDA (BDA10kDa) wurde für dieses Protokoll ausgewählt, weil es yields detaillierte Kennzeichnung von neuronalen Prozessen 6,7,9. Zusätzliche Vorteile BDA10kDa gehören die folgenden: Es ist bevorzugt in der anterograde Richtung 6-8 transportiert wird; sie kann durch iontophoretische oder Druckeinspritzung 6-8 geliefert werden; sie kann durch einen einfachen Avidin-biotinyliertem HRP (ABC) Verfahren 17 dargestellt werden; und es kann durch Licht- oder Elektronenmikroskopie 6,7,18 abgebildet werden. Immunchemischen Nachweis von CTb mit Peroxidase und DAB wurde für retrograde Markierung von Motoneuronen gewählt, weil es effektiv bei enthüllt zelluläre Prozesse einschließlich distalen Dendriten 10,19 ist. Vor kurzem haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Stimmkraftwegs in Mäusen zu identifizieren und ein Sparse-Verbindung vom primären Motorkortex den Kehlkopfmotorneurone, was bisher angenommen wurde 20 abwesend sein offenbaren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Transsynaptische Verfolgung hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug zur zentralen Efferenzen, die periphere Ziele durch Multi-synaptischen Schaltungen zu regulieren zu analysieren. Dieser Ansatz wurde sehr ausgiebig im Gehirn durch die Nutzung der Schweine pathogen Pseudorabies-Virus (PRV) 1 verwendet. PRV nicht infizieren, Menschenaffen, einschließlich des Menschen, so dass es am häufigsten in Studien von kleinen Säugetieren, vor allem Nagetiere. Die Pseudorabies-Stamm PRV152 drückt das enhanced green fluorescent protein (eGFP) Reportergen und kreuzt nur funktionierender Synapsen retrograd durch die hierarchische Sequenz der synaptischen Verbindungen von der Infektionsstelle 2,3. Andere PRV-Stämme haben unterschiedliche mikrobiologischen Eigenschaften und kann in beiden Richtungen (PRV-Becker und PRV-Kaplan) 4,5 transportieren. Dieses Protokoll wird ausschließlich mit PRV152 umzugehen. Durch die Bereitstellung der Virus bei einer peripheren Stelle, wie Muskeln, ist es möglich, den Eintritt des Virus in T GrenzEr Gehirn durch eine bestimmte Gruppe von Neuronen. Das resultierende Muster der eGFP-Signal über das gesamte Gehirn löst dann die Nervenzellen, die zu den ursprünglich infizierten Zellen verbunden sind. Da die verteilte Natur transsynaptische Tracing mit Pseudorabies-Virus macht die Interpretation spezifischen Verbindungen innerhalb eines identifizierten Netzwerk schwierig, präsentieren wir eine empfindliche und zuverlässige Verfahren, bei dem biotinylierte Dextran Amine (BDA) und Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) zur Bestätigung der Verbindungen zwischen Zellen identifiziert Verwendung PRV152. Immunochemische Detektion BDA und CTB mit Peroxidase und DAB (3, 3&#39;-Diaminobenzidin) wurde gewählt, weil sie effektiv bei der Aufklärung von zellulären Prozessen, einschließlich distalen Dendriten 6-11.

Färbung für eGFP sollten anfangen, die schwaches Signal in primären Motoneuronen in etwa 72 Stunden nach der Injektion in den Muskel PRV152. Replikation und transsynaptische Transport von Virus titer- und zeitabhängige 4. Etwa 90 Stunden nach der Injektion wird eGFP-Färbung zeigen robuste Signal in 2. Ordnung infizierten Zellen. Längere Überlebenszeiten werden offenbaren 3. und höherer Ordnung Zellen, aber die Überlebenszeiten durch die Letalität von PRV auf etwa 5 Tage nach de...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsynaptische Tracing von Peripherie Targets mit Pseudorabies-Virus durch Cholera Toxin und biotinyliertes Dextran Amine Doppelmarkierung Gefolgt

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Serie: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...