Die Methode, die wir hier verwenden, kann helfen, Oligonukleotid mit einwandigem Kohlenstoff-Nanorohr zu verpacken, das eine neue Art von Nanopartikeln für die Medikamentenabgabe ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine effizientere Abgabe von Oligonukleotid-Medikamenten in Zellen in vivo. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Forschung multiples Myelom, weil es Nanopartikel eingeführt hat, um die Abgabe von Oligonukleotid-Medikamenten zu verbessern.
Durch diese Methode kann Einblick in die Behandlung von multiplem Myelom geben. Es kann auch auf andere Krankheiten angewendet und mit anderen Ladungen konjugiert werden, wie Proteine und kleine Moleküle. Mischen Sie zunächst ein Milligramm einwandiges Kohlenstoff-Nanoröhren, fünf Milligramm DSPE-PEG 2000-Amin und fünf Milliliter sterilisiertes Nuklease-freies Wasser in einer 20-Milliliter-Glas-Szintillationsdurchstechflasche.
Beschallen Sie die Durchstechflasche in einem Wasserbad-Sonicator bei einem Leistungsniveau von 90 Watt für eine Stunde bei Raumtemperatur. Zentrieren Sie die Durchstechflasche nach der Beschallung sechs Stunden lang mit 24.000 mal g. Dann sammeln Sie die Überstand-Lösung.
Fügen Sie einen Milliliter der einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrenlösung zu einem 100-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalfiltergerät hinzu, gefolgt von vier Millilitern sterilisiertem nukleasefreiem Wasser. Zentrifuge für 10 Minuten bei 4.000 mal g bei Raumtemperatur, um den überschüssigen Amin zu entfernen. Fügen Sie 0,5 Milligramm Sulfo-LC-SPDP zu 450 Mikrolitern der amin-funktionalisierten einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhre hinzu.
Dann 50 Mikroliter 10x PBS hinzufügen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes fügen Sie das Reaktionsgemisch zu einem 100-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalfiltergerät hinzu, gefolgt von vier Millilitern nukleasefreiem Wasser. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 Minuten bei 4.000 mal g bei Raumtemperatur, um den überschüssigen Sulfo-LC-SPDP zu entfernen.
Sammeln Sie die Sulfo-LC-SPDP-behandelte Amin-Einwand-Kohlenstoff-Nanoröhrenlösung, die im Filter verbleibt, und verdünnen Sie sie mit 500 Mikrolitern zuvor hergestellter Anti-MALAT1-Cy3-Lösung. Dann inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius über Nacht. Um die besten Vergleichsergebnisse zu erzielen, ordnen Sie nach dem Zufallsprinzip 14 Mäuse in Versuchs- oder Kontrollgruppen mit sieben in jeder Gruppe und mit dem gleichen Verhältnis von Mann zu Frau in jeder Gruppe an.
Als nächstes reinigen Sie die Operationsbank und sterilisieren Sie sie mit 70% Ethylalkohol. Verwenden Sie eine Heizlampe, um eine der Mäuse zu erwärmen, um die Schwanzvene erscheinen zu helfen. Halten Sie die Maus richtig mit einem Schwanz Injektion Restrainer.
Injizieren Sie MM.1S-luc/mCherry-Zellen in 50 Mikroliter PBS durch die Schwanzvene. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer für 30 Sekunden. Markieren Sie dann die injizierte Maus und geben Sie sie in einen sauberen Käfig zurück.
Am siebten Tag, nach der MM1S-Zellinjektion, injizieren Sie 50 Mikroliter PBS, die einwandige Kohlenstoff-Nanoröhren anti-MALAT1 enthalten, in die Schwanzvene der Maus. Drücken Sie dann die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer für 30 Sekunden. Beobachten Sie die lokale Blutung am Schwanz und das allgemeine Verhalten der Maus für eine Minute, und geben Sie sie dann in einen sauberen Käfig zurück.
Beobachten Sie alle injizierten Mäuse erneut, bevor Sie den Käfig ins Rack zurückbringen, um sicherzustellen, dass die Injektionen gut vertragen werden. Wägen Sie jede Maus vor der Zerlegung. Sammeln Sie peripheres Blut aus dem Herzen für einen vollständigen Blutbild-Assay, der von einer Blutkörperchen-Zählermaschine durchgeführt wird.
Als nächstes sammeln Sie die Gewebe des Knochenmarks, der Milz, des Lymphknotens, der Niere und des Gewebes mit sichtbarer Metastasierung. Extrahieren Sie RNA und Protein aus den Knochenmarkproben. Fixieren Sie alle verbleibenden Gewebe in Formalin.
Nach 24 Stunden Fixierung die Knochenproben zur Entkalkung fünf Tage lang in eine 0,5-molar-EDTA-Lösung eintauchen. Dann tauchen Sie alle Proben in 75%Ethylalkohol für die langfristige Lagerung. QRT PCR-Ergebnisse zeigten, dass Anti-MALAT1-GapmeR-DNA die MALAT1-Expression niederschlug und Apoptose in H929- und MM.1S-Zellen signifikant induzierte.
Einwandiges Kohlenstoff-Nanorohr-Anti-MALAT1-Cy3 wurde in den Zellkern von MM-Zellen geliefert und unterdrückte den endogenen MALAT1-Spiegel sowohl in H929- als auch mm.1S-Zellen signifikant. Die Lebensfähigkeit der BMEC-1-Zelle hat keinen signifikanten Unterschied nach der Behandlung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren-Anti-MALAT1-Cy3 oder Kontrolle bei verschiedenen Dosierungen und Zeitpunkten. Dies deutet darauf hin, dass die Toxizität von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren anti-MALAT1-Cy3 hat eine begrenzte und akzeptable Toxizität für normale Zellen bei hoher Dosierung.
Ein menschliches MM-disseminiertes Mausmodell wurde erstellt, um die Behandlungseffekte von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren anti-MALAT1 in vivo zu bewerten. Die Luziferonsignale von Mäusen in der einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren-Anti-MALAT1-Behandlungsgruppe waren im Vergleich zur Kontrolle nach 21 Behandlungstagen deutlich niedriger. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die einwandige Kohlenstoff-Nanorohr-Anti-MALAT1-Behandlung mittels intravenöser Injektion die Anti-MALAT1-Oligos effektiv an Tumorzellen liefern könnte.
Es wurden keine signifikanten Nebenwirkungen der Behandlung beobachtet, was darauf hindeutet, dass einwandige Kohlenstoff-Nanoröhren-Anti-MALAT1-Injektion eine sichere Behandlung für Mäuse ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zusammensetzung des Zellmoleküls die Lieferung, Effizienz und therapeutische Wirkung der Oligonukleotid-Medikamente beeinflussen wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Konjugation von Proteinen oder kleinen Molekülen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.
Wie die Verwendung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren, um andere Medikamente zu liefern.
