Unser Labor in Johns Hopkins hat mit über zwei Jahrzehnten Erfahrung eine kleine Nieren- und Lebertransplantation durchgeführt. Dieses spezifische Protokoll skizziert kritische Schritte, die für die erfolgreiche Durchführung der orthotopischen Nierentransplantation bei Ratten erforderlich sind. Um die Wahrscheinlichkeit und Reproduzierbarkeit des Erfolgs zu erhöhen, umfasst unser Protokoll drei markante Schritte, die Durchblutung der Spenderniere durch die Portalvene und die Verwendung eines Manschettensystems zur Anastomose der Nierenvenen und Harnleiter.
Demonstriert dieses Verfahren wird Dr.Le Qi, ein Student in unserem Labor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie die Spenderratte, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position und immobilisieren Sie die Gliedmaßen mit sterilem Klebeband.
Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf und sterilisieren Sie das Operationsfeld, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie vor dem ersten Schnitt sicher, dass die Ratte angemessen betäut wird, indem Sie das Fehlen des Entzugsreflexes der Zehenprise überprüfen. Beginnen Sie mit der Schere, indem Sie einen großen Längsmittelhaut- und Muskelschnitt von der Symphyse pubis zum Xiphoid machen und in die Peritonealhöhle gelangen.
Bedecken Sie den Darm mit einer feuchten sterilen Gaze und verschieben Sie ihn auf die rechte Seitenseite des Bauches, der die Aorta, Vena cava und die linke Niere freilegt. Tragen Sie einen Milliliter vorgeheizte Saline mit einer Ein-Cc-Spritze auf, um den Darm und die Bauchorgane feucht und bei normaler Temperatur zu halten. Tragen Sie eine zweite feuchte Gaze auf, um den Magen und milden Schädel auf die Niere zu bedecken und zu mobilisieren.
Dann fügen Sie eine kleine feuchte Gaze, um die exponierte Niere zu bedecken. Verwenden Sie mikrochirurgische Sezieren Zangen zu isolieren und mobilisieren Sie die linke Nierenarterie und Vene aus dem Bindegewebe und einander. Isolieren Sie nun die linke Nierenvene, indem Sie die linke Gonadenvene kauterisieren und die linke Nierenarterie isolieren, indem Sie die Nebennierenarterie kauterisieren.
Danach mobilisieren Sie die Aorta und Vena cava überlegen und unter dem linken Nierenpedikum, indem Sie das Bindegewebe mit sezierenden Zangen sezieren. Teilen und mobilisieren Sie den Harnleiter aus dem Bindegewebe mit Sezieren Vonzangen, dann verwenden Sie Mikroschere, um einen diagonalen Schnitt in einer Länge von etwa zwei Zentimetern vom Nierenbecken gemessen zu machen. Legen Sie eine Polyamidmanschette auf halbem Weg in den Harnleiter ein und sichern Sie die Manschette, indem Sie einen Knoten mit 8-0 Seide Naht.
Mobilisieren Sie die linke Niere, indem Sie sie mit Sezierungszangen oder Mikroscheren vom perinephrischen Fett trennen. Lassen Sie die Fettkapsel der Niere anhängen und verwenden Sie diese Stelle für den Umgang mit der Niere. Nun 200 Einheiten Heparin mit einer Spritze mit einer 27-Spur-Nadel durch die Penisvene zu verabreichen.
Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem Wattestäbchen mindestens eine Minute lang, um Blutungen zu verhindern. Identifizieren Sie die Portalvene und die minderwertige Vena cava. Setzen Sie die minderwertige Vena cava aus.
Bereiten Sie sich darauf vor, die Niere zu spülen, indem Sie 50 Milliliter kalter Saline mit 500 Einheiten Heparin in die Portalvene mit einer 16-Spur-Nadel injizieren. Vor dem Spülen die untere Vena cava auf der Infrahepatischen Ebene schneiden und die Portalvene kaudal an der Nadeleinfügungsstelle schneiden, damit das Blut den Kreislauf verlassen kann. Beginnen Sie mit dem Spülen der Niere, indem Sie die Salinelösung nach und nach infundieren.
Beobachten Sie eine Farbänderung der Niere von dunkelrot zu einer einheitlichen grauen oder blassen Farbe. Nach dem Spülen die Nierenarterie und venesproximal zur Aorta und Vena cava liganieren. Legen Sie die gespülte Niere in eine Petrischale mit kalter Saline auf Eis, bevor Sie den Körper des Spenders aus dem operationschirurgischen Feld entfernen.
Sobald die Niere in kalter Herzlösung ist, fixieren und immobilisieren Sie den Griff der Venenmanschette und ziehen Sie die Nierenvene vorsichtig durch die Manschette. Fixieren Sie dann die Nierenvene über der Manschette, indem Sie drei Knoten mit 8-0 Seide Naht. Wiederholen Sie die Schritte vom Spenderverfahren bis zur Heparin-Administration, um mit dem Empfängerverfahren zu beginnen.
Dann legen Sie zwei atraumatische Mikrogefäßklemmen auf die linke Nierenarterie und Venenproximal zur Aorta und Vena cava. Ligate die Renimvene proximal an den Einlass der Niere. Spülen Sie die Nierenvene mit heparinisierter Saline, um das gesamte restliche Blut aus dem Gefäß zu entfernen.
Schieben Sie die ligaierte Nierenvene über die gefesselte Nierenvene, die zuvor in der Spenderniere positioniert war. Dann sichern Sie die Vene mit einem 8-0 Seide Naht. Behalten Sie die gleiche Positionsausrichtung bei der Sicherung der Nierenvene über der Manschette.
Ligate die Nierenarterie proximal an den Einlass der Empfängerniere. Spülen Sie es mit heparinisierter Saline, um überschüssiges Blut im Gefäß zu entfernen. Nun ligate den Harnleiter auf Höhe des unteren Pols der linken Niere.
Mobilisieren Sie die Niere aus dem perinephrischen Fett und entfernen Sie die native Niere. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose der Nierenarterie mit 8-10 unterbrochenen Nähten mit einer 10-0 Nylon-Nähte durch. Manövrieren Sie die Arterie mit der adventlichen Schicht.
Entfernen Sie die Gefäßklemmen, um die Reperfusion der Niere wieder zu initiieren. Beginnen Sie mit dem Entfernen der Klemme an der Vene, gefolgt von der Klemme an der Arterie. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um leichten Druck zu allen nässenden Bereichen rund um die Anastomose-Region hinzuzufügen.
Ein paar Minuten sollten ausreichen, um eine Patentanastomose zu erreichen. Beobachten Sie kurz die Niere, um eine ausreichende Durchblutung zu beurteilen. Unmittelbar nach der ErneuteBeblutung sollte die Niere ihre Farbe ändern und nach wenigen Minuten allmählich ihre natürliche dunkelrote Farbe wiedererlangen.
Gelegentlich werden eine sichtbare Peristaltik des Harnleiters und der Urinproduktion vor Ort beobachtet. Beenden Sie die freiliegende Spitze der Harnleitermanschette in den Empfängerharnleiter und sichern Sie den Empfängerharnleiter mit einem 8-0 Seide Krawatte. Um die Harnleiter des Spenders und des Empfängers in Position zu halten, binden Sie die Enden jeder Harnleiterseite aneinander.
Optional nephrectomisieren Sie die rechte Niere, indem Sie den Nierenpedikel mit einer 3-0 Seidennaht binden. Entfernen Sie alle Gazen aus der Bauchhöhle und bringen Sie alle Organe in ihre natürliche Position zurück. Dann spritzen Sie einen Milliliter Saline über den Darm, um sie feucht zu halten.
Schließen Sie den Bauch, indem Sie eine 4-0 resorbierbare Naht am Rectusmuskel und eine 4-0 Seidennaht verwenden, um die Hautschicht unterbrochen zu schließen. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Zugang zu ad libitum Wasser und Nahrung und ermöglichen sie für die Erholung auf einem 37 Grad Celsius Heizkissen. Beobachten Sie die Bergung für ein bis zwei Stunden, bevor Sie das Tier zurück in die Tieranlage zurückbringen.
Tiere mit einer syngenischen Nierentransplantation erreichten ein langfristiges Überleben ohne immunsuppressive Behandlung. Umgekehrt lehnten Tiere, die eine allogene Nierentransplantation ohne Immunsuppression erhielten, ihr Transplantat ab und erlagen nierenversagen mit einem medianen Überleben von acht Tagen. Mittleres Serumkreatinin nahm in der syngenischen Gruppe leicht zu, während es in der allogenen Gruppe um das 14-fache zunahm.
Bei der Explantation zeigte die makroskopische Ansicht des syngenischen Nierenallographen keine Anomalien. Die Nierenfarbe und die inneren Strukturen blieben intakt. Im Gegensatz dazu präsentierten Nierenallographen von abgelehnten Tieren rote hämorrhagische Flecken mit der Zerstörung der inneren Strukturen.
Hämatoxylin- und Eosinflecken syngenischer Transplantate zeigten dünne glomeruläre Kapillarschlaufen mit einer normalen Anzahl von endothelialen und mesangialen Zellen. Abgelehnte Allographen zeigten zerstörte glomeruläre Strukturen mit Anzeichen von Entzündungen und Tubulitis. CD8 positive Färbung wurde durchgeführt, um T-Zelle vermittelte Ablehnung zu bestätigen.
Während syngene Allographen nur sehr wenige CD8-positive T-Zellen zeigten, zeigten die abgelehnten Allographen eine signifikant höhere Anzahl von CD8-positiven Zellen in und um die Glomeruli und Tubuli, die die t-zellvermittelte Abstoßung bestätigten. Dieses Modell bietet einen signifikanten Einblick in die immunologischen Phänomene der Abstoßung, Toleranz und Spender-Wirt-Wechselwirkungen, die den Weg für die Entwicklung therapeutischer klinischer Interventionen bei der Transplantation fester Organe ebnen.
