Diese Methode bietet einen kostenlosen präklinischen Ansatz für die Untersuchung der unmittelbaren zellulären Reaktion auf Blut im Gehirn nach einem hämorrhagischen Schlaganfall, eine sehr ernste Erkrankung, für die wir keine spezifischen Medikamente für Patienten zur Verfügung haben. Im Gegensatz zu Nagetiermodellen ermöglicht uns die Transparenz von Zebrafischlarven, zelluläre Reaktionen im Gehirn lebender intakter Tiere in Echtzeit mithilfe der fluoreszierenden Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie zunächst ein Teesieb, um alle befruchteten Embryonen aus dem natürlichen Laichen in Zuchtboxen zu sammeln, die von einem männlichen und einem bis zwei weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt werden.
Übertragen Sie 100 Embryonen auf jede Petrischale, die das Standard-E3-Embryomedium enthält. Inkubieren bei 28 Grad Celsius und Stufe nach Standard-Richtlinien. Nach sechs Stunden nach der Befruchtung tote und unbefruchtete Embryonen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale entfernen und das Geschirr wieder in den Brutkasten geben.
Nach der Befruchtung 24 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter einem hellfeldigen Stereomikroskop scharfe ultradünne Sezierzangen, um Embryonen für die Atorvastatin-Behandlung zu dekoorizieren. Dann fügen Sie 30 Milliliter E3 Embryo Medium zu zwei sauberen Petri-Schalen, eine für die Behandlung und die andere für die Kontrolle. Entfernen Sie 60 Mikroliter Embryowasser aus der Behandlungsschale und fügen Sie 60 Mikroliter 0,5 Millimolar Atorvastatin hinzu, um 80 % der blutüberstten Larven zu erreichen.
Mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich auf jede Schale übertragen. Die beiden Gerichte bei 28 Grad Celsius bebrüten. Nach 50 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pasteur-Pipette, um bluterwerdende Fische sorgfältig von nicht blutrünstigen Populationen zu trennen und die Larven auf neue Gerichte mit frischen E3-Medien zu übertragen.
Um es einfacher zu machen, Blutungen positive Larven zu trennen, könnten Sie Fische ohne Pigment oder Fische verwenden, die fluoreszierendes Protein in roten Blutkörperchen ausdrücken. Am dritten Tag, unter einem fluoreszierenden Mikroskop Bildschirm die Larven, um die Expression von fluoreszierendem Protein zu gewährleisten. Dann füllen Sie die Lichtbogen-Montagekammer mit E3-Medien, die 0,2%MS-222 zur Anästhesisierung enthalten.
Mit einer Pasteur-Pipette ein einzelnes Tröpfchen mit ein bis sechs Larven zur Montage auf eine trockene Petrischalenoberfläche übertragen. Verwenden Sie eine Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Fügen Sie einen Tropfen von 1,5% niedrige Schmelze Agarose aus dem 45 Grad Celsius Wärmeblock zu den Larven und verwenden Sie eine 800 Mikrometer Montage Kapillare, um die Larven Nachoben Kopf zuerst zu ziehen.
Wenn die Positionierung nicht korrekt ist, vertreiben Sie die Larven aus der Agarose und montieren Sie sie wieder. Lassen Sie die Kapillare abkühlen und legen Sie sie dann in die Lichtbogenkammer ein. Drücken Sie auf die ZEN-Bildgebungssoftware kontinuierlich, um die Larven zu orientieren, und erfassen Sie z-stack-Bilder des Kopfes zwischen den Augenlinsen.
Generieren Sie auf der Registerkarte Verarbeitung aus jedem Z-Stack ein Projektionsbild mit maximaler Intensität. Um nach dem Zufallsprinzip für motility assay auszuwählen, übertragen Sie 24 Larven nach der Anästhesie in frische E3-Medien und lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen. Nachdem sich die Larven vollständig von der Anästhesie erholt haben, mit einer Pipette mit dem Endschnitt transferiert wiedergewonnene Larven in E3 Medium ohne Methylenblau.
Platte eine Larve in einem Milliliter pro Brunnen einer 24 Brunnenplatte. Laden Sie die Platte in die Kamerakammer. Passen Sie in der EthoVision XT-Tracking-Software die Experimenteinstellungen an, um eine weiße Licht-Erschreckt-Routine einzurichten, um die spontane Schwimm- und Assay-Bewegung für 10 Minuten zu erhöhen.
Wiederholen Sie den Bewegungstest bei 96 und 120 Stunden nach dem Fertilizatin. Die Beurteilung des Hirnzelltodes unter Verwendung einer transgenen Ubiquitin-Sekretion Annexin V M venöse Reporterlinie führt zu eindeutigen Clustern sterbender Zellen in blutüberstten Larven, die in allen nicht blutüberstten Larven fehlen, die durch grüne Fluoreszenz angezeigt werden. Sterbende Zellen wurden sowohl in Atorvastatin als auch in Blasenkopfmodellen für blutüberlegte Larven beobachtet.
Die Morphologie der MPEG1-positiven Makrophagen ändert sich in intrazerebralen Blutungen, positive Larven, wenn die Zellen in aktiver abgerundeter Amoemoemoide-Form annehmen. Diese aktivierten abgerundeten Zellen wurden im Laufe der Zeit überwacht, um eine erhöhte phagozytische Reaktion des ubiquitin sezerzierten Annexin V M venös entrisierend sterbenden Zellen in intrachrraren Blutungen positive Larven zu zeigen. Hirnblutungen sind mit einer signifikanten Verringerung der Beweglichkeit bei 72 und 96 Stunden nach der Befruchtung im Vergleich zu intrazerebralen Blutungen negative Geschwisterkontrollen verbunden.
Die Beweglichkeit nach 120 Stunden nach der Befruchtung erholt sich auf ein Nahelandniveau. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist es, die Larven gründlich auf das Vorhandensein oder Fehlen von Hirnblutungen zu untersuchen, bevor Sie zu den Phänotypisierungstests übergehen. Dieses Modell kann auch für das Arzneimittelscreening verwendet werden, um festzustellen, ob die Schwere des Phänotyps nach einer Blutung verbessert werden kann, ein Ansatz, der uns dazu bringen kann, neue Arzneimittelkandidaten in der Zukunft zu identifizieren.
Diese Technik ermöglicht es uns, die zellulären Reaktionen unmittelbar nach einer Blutung im Gehirn während eines Zeitpunkts zu erforschen, der bisher so notorisch schwierig zu studieren war. Obwohl keines der in diesem Protokoll beschriebenen Reagenzien oder Instrumente besonders gefährlich ist, müssen bei der Verwendung von Chemikalien, Scharfen oder Lasern überall Standardsorgfalt und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.
