Glutathion S-Transferasen, GSTs, sind metabolische Enzyme, die intrazelluläre elektrophile Verbindungen abbauen und mit MAP-Kiinasen interagieren, die an Apoptose-Signalweg beteiligt sind. Aufgrund dieser beiden Rollen der Expression von GST ist mit Medikamentenresistenz korreliert, eine Lösung, um diesem Problem entgegenzuwirken ist, enzymatische Inhibitoren zu verwenden. Mit diesem Protokoll bieten wir eine Möglichkeit, solche Moleküle zu testen.
Diese Methode richtet sich an alle, die neu auf dem Gebiet der GST-Hemmer sind, die eine schnelle und einfache Methode zur Untersuchung der Enzym-Verbindung nutzen möchten. Wir bieten auch die Schritte, um zwei Merkmale eines Inhibitors zu bestimmen, die hemmende Konzentration 50, IC50, und die Konstante der Hemmung, Ki.As gut beschrieben wir die Technik, um die Art der Hemmung zu definieren, ein wichtiges Merkmal, das verschiedene biologische Folgen hat. Der erste Schritt besteht darin, die enzymatische Aktivität von GST in Lösung pro Einheit zu bestimmen.
Eine Einheit pro mil ist das Volumen des Enzyms benötigt, um ein Mikromolar des Produkts pro Minute zu synthetisieren. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration der Enzymlösung. Wählen Sie die Technik nach Ihrer Bequemlichkeit.
Verdünnen Sie die Proteinlösung auf eine Endkonzentration von 0,02 Milligramm pro mil in Wasser. Halten Sie die enzymatische Lösung auf Eis. Bereiten Sie die Reaktion in einer 96-Well-Platte vor.
Fügen Sie 20 Mikroliter Wasser für die leeren Brunnen hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter der enzymatischen Lösung für die Testbrunnen hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter GSH hinzu.
Fügen Sie 150 Mikroliter PBS hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter CDNB bei 50 Millimolar in jeden Brunnen. Mischen Sie die Platte auf einem Shaker für ein paar Sekunden.
Zeichnen Sie mit einem spektrophotometrischen Plattenleser die Absorption mit 340 Nanometern pro Minute für 10 Minuten auf. Analysieren Sie die Ergebnisse in einer Kalkulationstabelle und mit einer speziellen Software. Nach den erzielten Ergebnissen, bereiten Sie eine GST-Lagerlösung mit 0,1 Einheiten pro mil wasser.
Bereiten Sie sechs verschiedene Konzentrationen von CDNB 20 Mal in 95%Ethanol in einem Endvolumen von 200 Mikrolitern vor. In jeden Brunnen, fügen Sie 20 Mikroliter GSH bei 25 Millimolar. Zu den Testbrunnen, fügen Sie 20 Mikroliter der GST bei 0,1 Einheit pro mil.
Zu den leeren Brunnen, fügen Sie 20 Mikroliter Wasser. In jeden Brunnen, fügen Sie 150 Mikroliter PBS. Zu den Testbrunnen und den Leerenbrunnen 10 Mikroliter der entsprechenden CDNB-Lösung hinzufügen.
Jede CDNB-Konzentration benötigt ein bestimmtes Rohling. Mischen Sie den Inhalt auf einem Shaker für ein paar Sekunden, notieren Sie die Absorption bei 340 Nanometern pro Minute für 10 Minuten. Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer speziellen Software.
Bestimmen Sie den Km, indem Sie ein Michaelis-Menten-Diagramm zeichnen. Nach den Ergebnissen, bereiten Sie eine CDNB-Lösung bei 20-facher der erhaltenen Km in 95%Ethanol. Verdünnen Sie die Inhibitorlösung auf die erforderliche Konzentration.
In einer 96-Well-Platte, fügen Sie zwei Mikroliter des potenziellen GST-Hemmers hinzu. Zu den leeren Brunnen zwei Mikroliter des Verdünnungsverdünnungsguts hinzufügen. Fügen Sie 20 Mikroliter GSH bei 25 Millimolar in jeden Brunnen und 168 Mikroliter PBS.
Fügen Sie 10 Mikroliter CDNB 20 mal Km während des vorherigen Schritts gefunden. Mischen Sie die Platte auf einem Shaker für ein paar Sekunden. Zeichnen Sie die Absorption mit 340 Nanometern pro Minute für 10 Minuten auf.
Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer speziellen Software. Den Ergebnissen zufolge kann für jeden GST-Inhibitor derselbe Rohling verwendet werden oder muss angepasst werden. Bereiten Sie neun Konzentrationen des getesteten GST-Hemmers vor.
Bereiten Sie die Essaylösung vor, die aus 148 Mikroliter PBS und 20 Mikroliter GSH bei 25 Nanomolaren für eine Reaktion besteht. Gut der Lösung mischen. Für die Testbrunnen zwei Mikroliter GST-Hemmer, 20 Mikroliter GST, 0,1 Einheit pro mil und 168 Mikroliter der Assay-Lösung hinzufügen.
Für die Kontrollbrunnen zwei Mikroliter des für den GST-Inhibitor verwendeten Verdünnungsverdünnungsfehlers, 20 Mikroliter GST 0,1 Einheit pro mil und 168 Mikroliter der Assaylösung hinzufügen. Für die Rohbrunnen zwei Mikroliter des für den GST-Inhibitor verwendeten Verdünnungsverdünnungs-Hemmers, 20 Mikroliter Wasser und 168 Mikroliter der Assaylösung hinzufügen. Fügen Sie 10 Mikroliter der CDNB-Lösung für jeden Brunnen hinzu, einschließlich des Rohlings.
Mischen Sie auf dem Shaker für ein paar Sekunden. Zeichnen Sie die Absorption mit 340 Nanometern pro Minute für 10 Minuten auf. Berechnen Sie den IC50 mit einer speziellen Software.
Bereiten Sie vier CDNB-Lösungen in unterschiedlichen Konzentrationen vor, wie im Protokoll erläutert. Bereiten Sie drei GST-Hemmerlösungen in unterschiedlichen Konzentrationen vor, wie auch im Protokoll erläutert. Bereiten Sie die enzymatischen Lösungen mit 148 Mikroliter PBS und 20 Mikroliter GSH bei 25 Millimolar für eine Reaktion vor.
Für die Kontrollbrunnen zwei Mikroliter des verdünnten Verdünnungsstoffs hinzufügen, das für den GST-Hemmer verwendet wird. Und für den Test und die Rohbrunnen zwei Mikroliter der richtigen GST-Hemmerlösung. Mischen Sie für ein paar Sekunden.
Fügen Sie 168 Mikroliter der enzymatischen Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter der entsprechenden CDNB-Konzentrationen in jeden einzelnen Brunnen ein. Mischen Sie für ein paar Sekunden, dann nehmen Sie die Absorption bei 340 Nanometer pro Minute für 10 Minuten auf.
Wiederholen Sie das Experiment mit dem gleichen Beschichtungsmuster, um die vier verschiedenen Konzentrationen von CDNB entlang der drei verschiedenen Konzentrationen des GST-Inhibitors zu verwenden. Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer spezialisierten Software, um die Art der Hemmung zu bestimmen, sowie das Ki.Dieses Protokoll wurde auf Curcumin angewendet, ein Molekül mit Anti-Krebs-Eigenschaften. Diese Verbindung wurde durch rechnerische Vorhersagen der Bindungsaffinität für mehrere GST-Isoformen ausgewählt.
Parallel dazu wurden die gleichen Experimente an Ethakrynsäure durchgeführt, dem am häufigsten verwendeten GST-Hemmer in der Laborumgebung als positivzusteuernd. Die hemmende Potenz wurde an einem Pool von GSTs aus Pferdeleber getestet und kann auf alle GST-Isoformen ihrer Wahl angewendet werden. Der IC 50 sowie die Art der Hemmung und das Ki wurden bestimmt.
Um die besten Assay-Bedingungen zu bieten, wurde zunächst Michaelis-Menten-Konstante, Km des Substrats CDNB mit einem GST-Pool ermittelt. Km ist repräsentativ für die Affinität zwischen dem Substrat und dem Enzym. Die Bestimmung dieses Wertes ist entscheidend, um eine nicht-sättige Konzentration für den Aufsatz zu verwenden.
Tatsächlich könnten zwei hohe Konzentrationen Wettbewerbshemmer benachteiligen, während zu wenig Menge nicht nachweisbar ist. Weitere Informationen hierzu finden Sie in den Texten. Für dieses Experiment wurden sechs verschiedene Konzentrationen von CDNB mit einer festen Konzentration von GSH- und GST-Enzymen verwendet.
Der Michaelis-Menten-Graph wurde durch Die Darstellung der Substratkonzentrationen in Millimolar auf der X-Achse und der Geschwindigkeit in Millimolar pro Minute auf der Y-Achse ermittelt. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Gleichung eins berechnet. Km wird als halb Vmax bestimmt, ein Wert, der nach der Sättigung der Lösung mit dem Substrat ermittelt wird, um ein Plateau der Konjugatbildung zu erhalten.
Der Km CDNB für die getestete GST-Enzymlösung wurde anhand von Berechnungen mit einer spezialisierten Software als 0,26 Millimolar ermittelt. IC50 ist definiert als die Konzentration der Substanz, die benötigt wird, um die Enzymaktivität um die Hälfte zu hemmen. IC50 wurde mit Hilfe eines nichtlinearen Regressionsdiagramms geschätzt, in dem die logarithmische Konzentration des GST-Inhibitors auf der X-Achse und der Prozentsatz der GST-Aktivität auf der Y-Achse dargestellt wurde.
Es wurden neun verschiedene Inhibitorkonzentrationen verwendet. Die GST-Aktivität wurde unter Anwendung von Gleichung 1 bestimmt. Die Ergebnisse wurden mit der Kontrolle mit dem No-Inhibitor normalisiert.
Curcumin ist schlecht in Wasser löslich. Daher waren höhere Konzentrationen nicht zu verwenden, was es schwierig machte, eine maximale Hemmung zu erreichen. Dennoch war eine spezialisierte Software in der Lage, den IC50 des Curriculums für diesen Pool von GST mit einem Wert von 31,4 Mikromolar vorherzusagen.
Parallel dazu wurde das gleiche Experiment mit Ethakrynsäure als positiver Kontrolle durchgeführt. Wie erwartet wurde dieses Molekül als GST-Hemmer mit einem IC50 von 6,7 Mikromolaren bestätigt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Curcumin auch ein GST-Hemmer mit einem IC50 im Mikromolar-Bereich ist, ähnlich wie Ethakrynsäure.
Um mehr im Detail Curcumin als GST-Hemmer zu studieren, die Art der Hemmung, sowie die Konstante der Hemmung, Ki, wurden bestimmt. Zunächst wurde die Art der Hemmung mit den Michaelis-Menten-Diagrammen bewertet. Durch die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Substrats CDNB bei gleichzeitiger Erhöhung der Konzentrationen des GST-Inhibitors erhöhte sich kms signifikant in Korrelation mit Curcumin-Konzentrationen, während Vmax trotz der unterschiedlichen Bedingungen unverändert blieb.
Diese Art der Hemmung ist typisch für eine wettbewerbsfähige Hemmungsart. Weitere Informationen zu den anderen Hemmungen finden Sie im Text. Ki wurde entsprechend berechnet, basierend auf der Art der Hemmung mit dem gleichen Datensatz, der einen Wert von 23,3 Mikromolar Curcumin liefert.
Die erklärten Methoden sind grundlegende enzymatische Essays, die Sorgfalt durch bestimmte Schritte erfordern, um korrekte und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Die Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km, die die Affinität des Substrats zum Enzym abgrenzt, ist einer der entscheidenden Schritte. In der Tat, wenn die Substratkonzentration zu hoch oder zu niedrig ist, macht es schwierig, die richtige Art der Hemmung zu identifizieren und Ki ist nicht richtig berechnet.
Dieses Verfahren kann auf humane rekombinante GSTs angewendet werden, wie z. B. GSTA1 und eine von P1, werden in Zellkulturstudien verwendet, um das Potenzial zu bewerten, das in Kombination mit elektrophilen Wirkstoffen verwendet werden kann, um die Arzneimittelresistenz zu reduzieren.
