Ye He und Rinat Abzalimov werden vom Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program unterstützt. Yuki Chen und Kelly Veerasammy werden vom CuNY Summer Undergraduate Research Program der Alfred P. Sloan Foundation unterstützt.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Advanced Science Research Center (ASRC) der City University of New York (CUNY).
1. Ernte das Gewebe
<ol><li>Bereiten Sie das Aluminiumboot vor. Bereiten Sie ein Rechteck Aluminium 10cm x 20 cm vor, falten Sie es in der Mitte, um 10 cm Doppelschicht quadratisch zu machen. Beschriften Sie die Probeninformationen auf einer Seite und falten Sie die andere Seite, um ein Boot mit einer Unterseite von etwa 4 cm x 4 cm zu bilden.</li>
	<li>Das Boot auf dem flüssigen Stickstoff (LN2)in einer Styroporbox vorkühlen. HINWEIS: Wenn das Boot zu klein ist, kann die Probe aus dem Boot fallen und durch direkten Kontakt mit LN2übergefroren werden, was zu einer Fragmentierung während der Kryosektion führen kann.</li>
	<li>Euthanisieren Sie das Tier durch zervikale Dislokation nach institutionellen IACUC-Richtlinien, sezieren Sie sofort das Gewebe von Interesse.<ol>
<li>Halten Sie das Intervall zwischen Tieranästhesie und Schnappgefrieren so kurz wie möglich, um die Veränderung der Metaboliten während der Gewebeentnahme, insbesondere der labialen Metaboliten im Gehirn aufgrund einer postmortalen Ischämie, zu minimieren. HINWEIS: Die Durchblutung des Tieres mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erhöht die Dauer der Ischämie, verändert die Konzentrationen labiler Metaboliten weiter und übertreibt die künstlichen Ergebnisse. Daher wird das Perfusionieren oder Waschen des Gewebes mit PBS nicht empfohlen, es sei denn, die Kontamination von Blut oder Körperflüssigkeit ist von mehr Betroffener als die Verschlechterung der Metaboliten oder das Auswaschen für das individuelle Projekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie das Gewebe sofort in das Aluminiumboot, das auf flüssigem Stickstoff schwimmt, schließen Sie den Deckel der Styroporbox und frieren Sie je nach Größe des Gewebes 2-10 Minuten ein: 2 min, 5 min, 7 min für den postnatalen Tag 1 (P1), P21, P60 Mausgehirn bzw. 10 min für P60 Rattengehirn. HINWEIS: Frieren Sie das Gewebe nicht für längere Zeit ein (z. B. 5 Minuten für das P1-Mausgehirn), da das überfrorene Gewebe während der Kryosektion zu einer Gewebefragmentierung führen kann.</li>
	<li>Entfernen Sie das Boot mit einer Zette, falten Sie die Folie, um das Gewebe einzuwickeln, transportieren Sie es auf Trockeneis und lagern Sie es bei -80 °C für den späteren Gebrauch. Wenn eine sofortige Schnittung folgt, tragen Sie die Proben auf Trockeneis zum Kryostaten. HINWEIS: Um die Metaboliten besser zu erhalten, wird es bevorzugt, die Probe in intaktem Gewebe zu lagern und direkt vor der MALDI-Bildgebung zu abschnitten. Das Gewebe kann bei -80 °C bis zu 24 Monate gelagert werden.</li>
</ol>2. Kryosektion des Gewebes
HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit den Indium tinoxid (ITO)-Objektträgern jederzeit Handschuhe. Vermeiden Sie direktes Atmen auf dem Objektträger oder tragen Sie Masken (optional), um die Kontamination des menschlichen Speichels auf dem Gewebeabschnitt zu verhindern.
<ol><li>Bevor Sie das Gewebe teilen, sammeln Sie die gewünschte Anzahl von MALDI-kompatiblen ITO-beschichteten Glasobjektträgern.</li>
	<li>Testen Sie die Leitfähigkeit des Objektträgers mit einem voltmeter, das auf Widerstand eingestellt ist. Beschriften Sie die Seite, auf der eine Widerstandsmessung gelesen wird: Dies ist die Seite, an der die Gewebeabschnitte haften. Legen Sie den Dia immer auf ein sauberes Papiertuch, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Kühlen Sie die Dias in einem auf -20 °C eingestellten Kryostaten vor.</li>
	<li>Wenn Gewebeproben aus den -80 °C entfernt wurden, lassen Sie das Gewebe je nach Größe des Gewebes für ca. 45-60 min in der Kryostatkammer ausgleichen. Wenn Proben aus Trockeneis entfernt werden, gleichen Sie sie für ca. 30 Minuten aus.</li>
	<li>Reinigen Sie den Kryostaten gründlich mit 70% Ethanol. Kühlen Sie alle notwendigen Werkzeuge einschließlich dünnspitzigem Künstlerpinsel und Pinzette in der Kryostatkammer vor.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer und des Probenkopfes entsprechend der Art des Gewebes ein: -14 °C für Leber, -20 °C für Muskeln und -25 °C für Haut9.</li>
	<li>Montieren Sie das Gewebe mit Kryogewebe einbettender Verbindung OCT am Futter, um OCT aus dem interessierenden Bereich zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie eine saubere Klinge in die Bühne und verriegeln Sie. Stellen Sie die Position der Bühne und den Winkel der Probe ein, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen. HINWEIS: Wenn verschiedene Arten / Genotypen von Gewebe geschnitten werden sollen, stellen Sie sicher, dass Sie entweder die Probe neu positionieren, so dass ein sauberer Teil der Klinge verwendet wird, oder vor dem Schneiden der nächsten Probe zu einer neuen Klinge wechseln, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie weiter, bis die interessierende Region (z. B. Corpus callosum im Gehirn) gefunden ist. Achten Sie darauf, die Bühne sauber zu halten, indem Sie zusätzliche Stücke mit einem Künstlerpinsel abbürsten, der im Kryostaten ausgeglichen wurde.</li>
	<li>Sobald der gewünschte Bereich aufgedeckt ist, schneiden Sie kleinere Abschnitte von 10-12 μm Dicke. Wenn der Abschnitt dazu neigt, leicht zu flocken oder auseinanderzufallen, erhöhen Sie die Temperatur des Kryostaten und bleiben Sie im Bereich von -22 ° C bis -11 ° C. Wir haben festgestellt, dass die optimale Schnitttemperatur für Hirngewebe -15 °C bis - 18 °C beträgt.</li>
	<li>Sobald ein guter Abschnitt geschnitten wurde, kleben Sie ihn auf den ITO-Objektträger (in der Kryostatkammer arbeiten).</li>
	<li>Übertragen Sie einen Abschnitt des Gewebes mit der Spitze des Künstlerpinsels auf ITO-Dias.</li>
	<li>Erwärmen Sie den Abschnitt mit den Fingern, indem Sie einen Finger unter den Schlitten legen, um den Abschnitt aufzuwärmen, um eine sichere Montage zu gewährleisten. Der Gewebeabschnitt wird zuerst in 5-10 s transparent und dann in etwa 30-60 s undurchsichtig.</li>
	<li>Legen Sie den Schieber vorsichtig im Kryostaten beiseite.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte für andere Gewebeproben und stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt des Gewebes gleichmäßig auf dem Objektträger platziert und so ausgerichtet wie möglich ausgerichtet ist.</li>
	<li>Da das MALDI-Target bis zu zwei Objektträger aufnehmen kann, platzieren Sie die Abschnitte aus mehreren Proben derselben Kohorte auf einem einzigen Objektträger oder auf zwei Objektträgern, um sicherzustellen, dass sie gleichzeitig analysiert werden können.</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, legen Sie ITO-Dias in eine Vakuumbox und geben Sie sie mit Trockenmittel in einen Trockenmittel. Vakuumtrocknen Sie den Schlitten für 45-60 min. HINWEIS: Wenn im Labor kein Vakuum-Aussauger verfügbar ist, halten Sie die Objektträger ständig unter -20 °C, um eine Verschlechterung der Metaboliten zu vermeiden.</li>
	<li>Lagerung und Versand von Objektträgern: Sofern die Probe nicht von den MALDI-Bildgebungskerneinrichtungen vorbereitet wird, um direkt mit der MALDI-Bildgebung fortzufahren, lagern Sie die Objektträger bei -80 ° C oder versenden Sie sie an Kerneinrichtungen oder andere MALDI-Forschungslabors auf Trockeneis.</li>
	<li>Um die Proben bestmöglich zu konservieren, legen Sie die Dias in den Diatransporter, füllen Sie ihn mit Stickstoff (optional), versiegeln Sie ihn mit Parafilm, legen Sie ihn in einen Reißverschlussbeutel, der dann in einen anderen Reißverschlussbeutel mit Trockenmittel gelegt wird. Beschriften Sie den äußeren Reißverschlussbeutel.</li>
	<li>Lagerung bei -80 °C (bis zu 6 Monate) oder Versand mit ausreichend Trockeneis.</li>
</ol>3. Matrixvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Matrix vor. HINWEIS: Alle Reagenzien müssen HPLC-Grad haben.<ol>
<li>NEDC in einer Konzentration von 10 mg/ml zubereiten. 10 ml Matrix in einem Lösungsmittel aus 70% Methanol gelöst (100 mg NEDC, 7 ml Methanol, 3 ml H2O) werden10ml Methanol vorbereitet.</li>
		<li>Bereiten Sie zusätzlich eine zusätzliche 10 ml 70% ige Methanol: Wasserlösung vor, um das Sprühsystem vor dem Einfüllen der Matrix zu spülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Objektträger in Schritt 2.17 dehydriert sind, platzieren Sie "X" -Markierungen auf den leeren Raum des Glasobjektträgers außerhalb der Gewebeabschnitte mit einem fetten Punkt Silbermarker und legen Sie dann ein zweites "x" mit einem feinen Punkt schwarzen Marker auf das silberne "X". Das schwarze "X" mit einem scharfen Kontrast aus dem silbernen Hintergrund (das fette silberne "X") wird später als treuhänderischer Marker für die spätere Massenspektrenerfassung im MALDI-Instrument dienen.</li>
	<li>Laden Sie den Schlitten in das MALDI-Gleitmetallziel. Verwenden Sie eine Kunststoffabdeckung und zeichnen / umreißen Sie, wo sich die Proben auf der Kunststoffabdeckung befinden. Verwerfen.</li>
	<li>Scannen Sie das Bild des Dias zusammen mit dem MALDI-Target mit einem Flachbettscanner. Die Schrauben auf der Oberfläche des Ziels dienen als Abstandhalter, um die Beschädigung oder Kontamination des Gewebeabschnitts durch den Scanner zu verhindern. Zeigen Sie eine Vorschau des ausgewählten Folienbereichs in 16-Bit-Graustufen und 2400 dpi an und scannen Sie ihn. Speichern Sie das Bild für die spätere Verwendung in MALDI MSI.</li>
</ol>4. Matrixabscheidung
HINWEIS: Es gibt mehrere Methoden, um eine gleichmäßige Matrixschicht in feiner Kristallgröße auf den MALDI-Dia aufzutragen, einschließlich Sublimation, Tröpfchen-Inkjet-Druck, automatisches Matrixsprühgerät und manuelles Spray mit Künstler-Airbush9. Wir werden in diesem Protokoll ein automatisches Matrix-Sprayer als Beispiel für seine hohe Reproduzierbarkeit verwenden.
<ol><li>Start: Schalten Sie die Matrix-Sprüheinheit ein, stellen Sie sicher, dass das Ventil bei LOAD positioniert ist, und starten Sie die Sprühsoftware. Überprüfen Sie, ob der Abluftventilator gut funktioniert. Starten Sie die Lösungsmittelpumpe nicht, wenn die aktive Entlüftung nicht ordnungsgemäß funktioniert.</li>
	<li>Bestätigen Sie auf der Registerkarte Comms, dass alles kommuniziert, und starten Sie dann die Lösungsmittelpumpe bei 0,1 ml/min mit einem Gegendruck von ~500 psi (oder 3,4 MPa).</li>
	<li>Starten Sie den Druckluftstrom zum Matrixsprühgerät, indem Sie den Stickstofftank auf 30 psi einstellen. Stellen Sie dann den Druckregler an der Vorderseite des Sprühgeräts auf 10 psi ein und stellen Sie die Temperatur der Sprühdüse wie gewünscht ein. HINWEIS: Wenn der Luftdruck im Gebet niedriger als 5 psi ist, kann sich die Sprühdüse zum Schutz nicht erwärmen.</li>
	<li>Wenn sich das Ventil noch in der LOAD-Position befindet, verwenden Sie eine Spritze, um den Kreislauf mit 7 ml 70% Methanol zu spülen, und füllen Sie dann den Kreislauf mit 6 ml Matrix.</li>
	<li>Legen Sie die Gewebeschieber in die Halter im Sprühgerät und klebten Sie beide Enden ab, um Bewegungen zu verhindern und eine matrixfreie Kante zu erhalten, um die Kontamination der Metallklemme auf dem MALDI-Target durch die Matrix zu vermeiden. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, zuerst Matrixspray auf einem blanken Objektträger zu testen, bevor Sie mit wertvollen Probenobjektträgern fortfahren.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die Durchflussrate und die Temperatur stabil sind, um mit dem Sprühen zu beginnen.</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschte Methode vorgetestet mit leerem Glasträger.</li>
	<li>Drücken Sie Start. Dadurch wird die Düsentemperatur eingestellt und der Pumpendurchfluss an die gewählte Methode angepasst. Schalten Sie das Ventil von Last in Sprühposition und bestätigen Sie dann, indem Sie auf Weiterklicken.</li>
	<li>Lassen Sie das System laufen, was je nach Methode 5-20 Minuten pro Schlitten dauert. Schalten Sie das Ventil von Spray in Load Position und bestätigen Sie dann, indem Sie auf Weiter klicken, wenn Sie fertig sind.</li>
	<li>Entfernen Sie die Objektträger aus dem Sprühgerät, untersuchen Sie das Muster der Matrixbeschichtung unter dem Mikroskop, um eine gleichmäßige Schicht aus feinem Matrixkristall zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach der Matrixabscheidung legen Sie den/die Schlitten zur sofortigen Verwendung in den MALDI-Metallhalter. Wenn nur ein Probenobjektträger vorhanden ist, fügen Sie einen weiteren leeren Objektträger hinzu, um die beiden Felder des MALDI-Halters zu füllen.</li>
	<li>Reinigen Sie das System sofort nach dem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Verstopfen der Sprühdüse zu verhindern.</li>
	<li>Nachdem der Probenträger mit Matrix beschichtet wurde, fahren Sie entweder sofort mit dem MALDI-Bildgebungsinstrument fort oder versenden Sie es mit Trockeneis unter Verwendung der gleichen Doppelreißverschlussbeutelvorbereitung, die in Schritt 2.19 beschrieben wurde. HINWEIS: Unter Notfallbedingungen, wie z. B. wenn das MALDI-Instrument nicht für den sofortigen Gebrauch verfügbar ist, lagern Sie den beschichteten Objektträger im Vakuumzustand oder bei -20 ° C für bis zu 24 Stunden, obwohl die Verschlechterung einiger Metaboliten während der Lagerung auftreten kann, die nicht gründlich untersucht wurde.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) ist eine markierungsfreie Bildgebungstechnik, mit der Forscher die Verteilung verschiedener Biomoleküle und deren Modifikationen im Gewebe, der molekularen Grundlage der Pathologie, untersuchen können. Die kombinierte Verwendung von MALDI-MSI mit traditionellen LC-MS-Ansätzen für die Gewebeanalyse bietet die gleiche molekulare Tiefe wie herkömmliche Omics-Workflows, behält aber auch die räumliche Beziehung dieser Signale innerhalb des Mobilfunknetzes bei. Die Probenvorbereitung ist der kritischste Schritt in MALDI MSI und berücksichtigt die Variation der endgültigen Auslesungen von Metabolomik-Studien, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden4. Hier bieten wir ein umfassendes, aber praktisches Protokoll zur Standardisierung der Probenvorbereitung für die metabolomische Profilierung mit MALDI MSI, in der Hoffnung, dass es einer breiten Forschungsgemeinschaft zugute kommt, MALDI MSI in ihrer aktuellen und zukünftigen Forschung von der Grundlagenbiologie bis hin zu translationalen Studien zu implementieren.
Man muss immer alle Vorkehrungen beachten, um Veränderungen der molekularen Profile (sowohl Häufigkeiten als auch räumliche Verteilung) während der Probenvorbereitung zu minimieren und Kontaminationen zu vermeiden. Erstens, minimieren Sie die Zeit zwischen tierischer Euthanasie und Gewebeentnahme, wie z.B. in situ eingefroren oder durch Mikrowellenfixierung erhitzt, um Enzyme im Gehirn zu inaktivieren, um die Haftung für postmortale Ischämie zu reduzieren4,5,6. Zweitens ist der Schnappgefrierzustand der Probe kritisch. Unzureichendes Einfrieren führt zum Abbau und Verlust der Metaboliten, während ein Überfrieren zu einer Gewebefragmentierung während der Kryosektion führt. Die Gefrierzeit sollte immer zuerst nach früheren berichteten Studien getestet werden, und die in diesem Artikel vorgestellte Studie des Entwicklungsgehirns von Mäusen liefert die Referenzpunkte für nagetieriges Hirngewebe. Drittens erfordert das Schneiden von biologischem Gewebe und das Übertragen ihrer Abschnitte auf die ITO-Objektträger angemessene Übung. Es ist wichtig zu beachten, dass beim Verwenden des Pinsels, um den Abschnitt von der Bühne aufzunehmen, der Pinsel vorsichtig verwendet werden sollte. Lassen Sie die Borsten der Bürste nur mit den Rändern des Gewebeabschnitts in Kontakt kommen, um das Risiko einer Kontamination und Abschnittsfragmentierung zu verringern. Flachen Sie den Abschnitt auf dem Dia so weit wie möglich ab, dies verhindert das Kräuseln des Abschnitts während der Fingererwärmung. Viertens, stellen Sie bei der Montage auf dem ITO-Objektträger sicher, dass der gesamte Abschnitt gut mit dem ITO-Objektträger verbunden ist, da verschiedene Regionen des Gewebes eine unterschiedliche Zeit der Fingererwärmung erfordern können. Zum Beispiel benötigt Hirntumorgewebe eine längere Aufwärmzeit als normales Hirngewebe. Eine schlechte Montage kann zu einer Ablösung und Fragmentierung des Gewebes während des MALDI-MS-Scans führen. Denken Sie daran, dass die Fingererwärmung die Enzymwirkung und den Stoffwechsel ermöglichen kann, was zu künstlichen Veränderungen der Metaboliten führt. Fünftens spielt eine feine und gleichmäßige Abscheidung der MALDI-Matrix eine wichtige Rolle bei der Erzielung genauer räumlicher Informationen und eines starken MALDI-MS-Signals. Es wird empfohlen, das Matrixsprühen auf einem blinden Objektträger zu testen und das Kristallmuster unter einem Mikroskop zu beobachten, um die ordnungsgemäße Abdeckung zu überprüfen, bevor Sie mit der Beschichtung des wertvollen Probenobjektträgers fortfahren. Und schließlich, da ein einzelner Forscher die Gewebeentnahme und die Objektträgervorbereitung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durchführt, wäre es ideal, eine Person zu haben, die die Probenvorbereitung für die Probe in derselben Kohorte übernimmt, um die Variation zu minimieren.
Das oben bereitgestellte Protokoll beschreibt Standardverfahren, die auf die Bedürfnisse bestimmter Experimente zugeschnitten werden können. Zum Beispiel kann ein Kryo-Schnittgel OCT, das normalerweise beim Kryo-Schnitten der Probe verwendet wird, weiter als Montagekleber auf dem Gewebefutter verwendet werden (wie in der oben beschriebenen Studie). Frühere Studien haben gezeigt, dass die Polymerkomponente in OCT eine starke Ionenunterdrückung verursacht14. Das Einbetten der Probe kann jedoch unvermeidlich sein, wenn das Gewebe zu zerbrechlich ist, um ohne zusätzliche Unterstützung durch ein Polymergel geschnitten zu werden. Um die Signalunterdrückung in diesen Fällen zu bekämpfen, müssen die Gewebe möglicherweise mit seriellem Waschen in 70% Ethanol und 95% Ethanol gewaschen werden, um Rest-OCT für den Nachweis von Proteinen oder Lipiden zu entfernen, während das Waschen für den Nachweis kleiner molekularer Metaboliten nicht empfohlen wird9.
MALDI MSI hat sowohl im Forschungslabor als auch in der klinischen Praxis zunehmend an Relevanz gewonnen. Zum Beispiel hat sich MALDI MSI kürzlich in Studien der Proteomik als nützlich erwiesen, um den phänotypischen Funktionsstatus eines Organismus zu charakterisieren15, und als Mittel zur mikrobiellen Identifizierung und Diagnose von Folgeerkrankungen16. Während MALDI MSI eine breite Palette von Anwendungen unterstützt, gibt es einige Einschränkungen, die damit verbunden sind, sich ausschließlich auf diese Technik zu verlassen, insbesondere wenn es um die Unterscheidung zwischen ähnlichen Spezies oder Metaboliten und die Identifizierung spezifischer Ziele geht. Eine weitere Herausforderung ist die Quantifizierung der Metabolitenkonzentration nach MALDI MSI-Signalen. Es wird oft angenommen, dass Ionenhäufigkeiten in MALDI MSI-Spektren und die räumliche Verteilung (oder relative Häufigkeiten) entsprechender molekularer Spezies über sezierte Gewebe gut korreliert sind. Man sollte jedoch immer bedenken, dass die Beziehung zwischen ionenintensität und der Menge der entsprechenden molekularen Spezies durch zahlreiche Faktoren kompliziert wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Auswirkungen der Ionenunterdrückung, Veränderungen der Gewebestruktur und Ionenmolekülreaktionen17. Techniken, die interne Standards nutzen, können zur absoluten Quantifizierung (μmol/g Gewebe) in MALDI-MSI18implementiert werden. Diese beiden Herausforderungen werden typischerweise mit dem kombinierten Workflow von MALDI MSI mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-MS(LC-MS/MS)-Techniken angegangen, wobei MALDI-MS die Kartierung der interessierenden Region ermöglicht, die später einer Mikroextraktion und LC-MS/MS unterzogen wird, um mehr Informationen zur Identifizierung des Metaboliten zu liefern19.
MS-basierte Bildgebungsverfahren wurden in den letzten Jahren als alternative Modalität zu früheren Techniken zur Abbildung niedermolekularer Metaboliten entwickelt. Mit den Fortschritten und der wachsenden Popularität von MALDI MSI wird erwartet, dass die MALDI-Bildgebung zu einem neuen Standardwerkzeug für die Visualisierung kleiner Moleküle wird. Von besonderem Interesse sind die Bildgebung von Lipiden und körpereigenen kleinen Molekülen (z.B. Neurotransmitter und Metaboliten) im biologischen Kontext sowie die Bildgebung von Xenobiotika für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe. Es wird erwartet, dass diese drei Bereiche in naher Zukunft schnelle Fortschritte mit der Anwendung von MALDI MSI machen werden20.

Metaboliten, die Zwischen- oder Endprodukte des Stoffwechsels, einschließlich Nukleotide, Aminosäuren oder organische Säuren, Lipide, sind Schlüsselkomponenten für biologische Funktionen und Prozesse. Die Metabolomik, die Untersuchung von Metaboliten, ermöglicht die Erforschung ihrer biochemischen Wechselwirkungen und das Verständnis ihrer Rolle im Kontext der Grundlagen-, translationalen und klinischen Forschung. Metaboliten sind stark mit den Phänotypen von Organismen assoziiert und geben Aufschluss über biochemische Aktivitäten, die während des Zellstoffwechsels auftreten1. Daher hat sich die Metabolomik neben der Genomik und Proteomik zu einem wichtigen Werkzeug zum Verständnis physiologischer und pathologischer Zustände entwickelt. Zum Beispiel wird die Metabolomik verwendet, um die Mechanismen hinter bestehenden Medikamenten sowie deren Toleranz zu klären. In der Arzneimittelentwicklung ist der xenobiotische Stoffwechsel nützlich, um die Aktivität oder Toxizität von Metaboliten über Spezies hinweg zu beurteilen, was später zur Unterstützung der personalisierten Medizinführt 2. Trotz der breiten Anwendung der Metabolomik kann die Bildgebung von Metaboliten aufgrund der chemischen Reaktivität, der strukturellen Heterogenität und des breiten Konzentrationsbereichs der Metaboliten eine Herausforderung darstellen3. Die Konzentrationen labiler Metaboliten, einschließlich hochenergetischer Verbindungen, Glukose, Laktat, Glykolytikum, Pentose-Shunt-Signalweg und TCA-Zyklus-Zwischenprodukte, Phospholipide, Neurotransmitter, Signalverbindungen, können sich jedoch innerhalb von Sekunden ändern und über Minuten fortschreiten, wenn Gewebeenzyme während der Gewebeentnahme aktiv sind, wie z. B. postmortale Ischämie bei der Gehirnernte4,5,6 . Um eine genaue Metabolomik-Datenerfassung zu gewährleisten, ist eine angemessene und sorgfältige Probenvorbereitung entscheidend7,8. Zu den derzeit etablierten Plattformen für die Messung von Metaboliten gehören NMR, Enzymassays und Massenspektrometrie (einschließlich Flüssigkeits- und Gaschromatographie), von denen die letzte weiter unten diskutiert wird.
MALDI-MSI ist eine hochmoderne Technik, die die Analyse komplexer Proben durch den Nachweis einzelner molekularer Spezies ermöglicht. MALDI MSI bietet den Vorteil, verschiedene molekulare Verbindungen in biologischen Proben schnell und reproduzierbar messen zu können. Die massenspektrometrische Bildgebung ermöglicht außerdem die Erstellung von Bildern, die die Gewebebiologie auf der Grundlage ihrer zusammengesetzten Metaboliten darstellen, und zwar unter Beibehaltung der räumlichen Verteilung der Metaboliten in der Probe9. Die Fähigkeit von MALDI, Analyten in einer Probe ohne die Verwendung von Antikörpermarkierung, strukturellen Modifikationen oder anderen spezialisierten Reagenzien, wie sie bei der Immunfärbung verwendet werden, nachzuweisen, in Verbindung mit seiner Fähigkeit, Hunderte von Molekülen innerhalb eines einzigen Experiments zu überwachen, sind nur einige der Vorteile, die ms imaging beim metabolischen Profiling gewährt10. ( 11) DER PRÄSIDENT. - Nach der 11 Neben häufig verwendeten Matrixen wie 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und 9-Aminoacridin (9-AA) hat die kürzlich entdeckte neuartige Matrix N-(1-Naphthyl) Ethylendiamindihydrochlorid (NEDC), die sich gut für Analysen verschiedener niedermolekularer Metaboliten eignet, die Anwendung von MALDI MSI im metabolischen Profiling weiter verbessert12.
Trotz der breiten Anwendung von MALDI MSI verhindern die hohen Kosten des Instruments und die Komplexität des experimentellen Verfahrens seine breitere Implementierung in einzelnen Forschungslabors. Daher werden die meisten MALDI MSI-Studien durch gemeinsame Kerneinrichtungen unterstützt. Die Probenvorbereitung, einschließlich Objektträgervorbereitung und Matrixbeschichtung, ist der kritischste Schritt in MALDI MSI. Die Objektträgervorbereitung wird jedoch normalerweise im Labor eines einzelnen Forschers durchgeführt, was zu möglichen Variationen bei der späteren MALDI-MSI-Erfassung führt. Hier wollen wir ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung biologischer Proben bereitstellen, bevor wir mit MALDI MSI-Messungen fortfahren, und ein metabolomisches Profiling des Entwicklungsgehirns der Maus als Beispiel verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

Die Metabolomik, die Studie zur Identifizierung und Quantifizierung kleiner Moleküle und Metaboliten, die in einer experimentellen Probe vorhanden sind, hat sich als wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der biologischen Aktivitäten während der Entwicklung und Krankheiten erwiesen. Metabolomik-Ansätze werden häufig bei der Untersuchung von Krebs, Ernährung / Ernährung, Diabetes und anderen physiologischen und pathologischen Zuständen mit Stoffwechselprozessen eingesetzt. Ein vorteilhaftes Werkzeug, das bei der metabolomischen Profilierung hilft, das in diesem Artikel befürwortet wird, ist die matrixgestützte Laserdesorption / Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI MSI). Seine Fähigkeit, Metaboliten in situ ohne Markierung, strukturelle Modifikationen oder andere spezialisierte Reagenzien, wie sie bei der Immunfärbung verwendet werden, nachzuweisen, macht MALDI MSI zu einem einzigartigen Werkzeug bei der Weiterentwicklung von Methoden, die auf dem Gebiet der Metabolomik relevant sind. Ein geeigneter Probenvorbereitungsprozess ist entscheidend, um optimale Ergebnisse zu erzielen, und wird im Mittelpunkt dieses Papiers stehen.

Das repräsentative Experiment wurde gemäß dem in Abbildung 1gezeigten Workflow durchgeführt. Die entwicklungsförderlichen C57BL Wildtyp-Mausgehirne des postnatalen Tages 1, 21, 60 (erwachsene) wurden wie oben beschrieben nach CUNY IACUC-Richtlinien geerntet und für 2, 5 bzw. 7 Minuten auf einem Aluminiumboot, das auf flüssigem Stickstoff schwimmt, eingefroren. Die gefrorenen Gewebe wurden bei 10 μm dicken Abschnitten bei −15 °C kryossektioniert, die sowohl für den Probenkopf als auch für die Kammer eingestellt waren. Die Gewebeschreibeschnitte wurden dann schonend auf die vorgekühlte leitfähige Seite von ITO-beschichteten Glasobjektträgern für die MALDI-Bildgebung übertragen. Montierte Kryosektionen auf ITO-Objektträgern wurden 45 min bei Raumtemperatur im Vakuum ausgetrocknet, gefolgt von der Matrixabscheidung mit einem automatischen Matrixsprühgerät. Matrix NEDC wurde verwendet, um Metaboliten nachzuweisen, und eine Matrixlösung von 10 mg/ml in Methanol/Wasser (70/30, v/v) wurde mit einer Durchflussrate von 0,1 ml/min und einer Düsentemperatur von 75 °C für 12 Zyklen mit 5 s Trocknung zwischen jedem Zyklus abgeschieden. Es wurde eine Sprühgeschwindigkeit von 1300 mm/min, ein Spurabstand von 2 mm, ein N2-Gasdruck von 10 psi und eine Durchflussrate von 3 L/min und eine Düsenhöhe von 40 mm verwendet.
MALDI-Massenspektren wurden im negativen Ionenmodus mit dem MALDI Time of Flight (TOF) MSI-Instrument aufgenommen. 0,5-1 μL rote Phosphoremulsion (Pn-Cluster mit n = 1 - 90) Emulsion in Methanol wurden auf den ITO-Objektträgern neben den montierten Geweben abgeschieden und verwendet, um das Instrument im Massenbereich von 100 - 1000 m/ z durch Anwendung der quadratischen Kalibrierkurve13zu kalibrieren. Die Laserspotdurchmesser wurden auf das modulierte Strahlprofil "Medium" für 50 μm Rasterbreite fokussiert. Spektren im Massenbereich von m/z 50 bis 1000 wurden bei 1000 Hz für 500 Aufnahmen aufgenommen. Massenspektrendaten wurden aufgezeichnet und die Bildgebung wurde mit der fortschrittlichen MALDI MSI-Datenanalysesoftware weiter analysiert. Ionenbilder wurden mit RMS-Normalisierung (Root-Mean Square) bei einer Behälterbreite von ±0,25 Da erzeugt.
Die Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen Ausgangsbilder der MALDI MSI-Datenanalysesoftware von m/z-Spektren, die aus jedem 100-Dalton-Intervall ausgewählt wurden, und zeigen deutlich den Nutzen für die Identifizierung von Spektren von niedermolekularen Metaboliten bis hin zu hochmolekularen Lipiden. Jede Zeile zeigt die jeweiligen Ionenwärmekarten, die sowohl räumliche als auch spektrale Informationen einer bestimmten Metabolitenspezies über drei Gewebe enthalten, die am postnatalen Tag 1, 21 und 60 gesammelt wurden. Für jedes repräsentative m/z kann die Analyse der regionalen Verteilung und Ionenhäufigkeiten verwendet werden, um relative Mengen entsprechender Arten zwischen verschiedenen Altersgruppen zu vergleichen. Eine Stärke der MALDI MSI-Methodik ist die Fähigkeit, die Spezifität bestimmter von m/z identifizierter Arten auf Entwicklungsmeilensteine oder spezifische anatomische Strukturen zu erkennen. Es wird beobachtet, dass einige Metaboliten bei P1-Neugeborenen angereichert (m/z 320.1), bei P60-Erwachsenen angereichert (m/z 846.5) oder gleichmäßig über Dasalter verteilt sind (m/z 480.3); andere molekulare Spezies sind spezifisch angereichert mit grauer Substanz (m/z 117.1; 524.3; 765.1), weißer Substanz (m/z 673.4; 846.5) oder CSF/Ventrikeln (m/z 239.0)(Abbildung 2A). Die räumliche Verteilung repräsentativer Metaboliten einschließlich Hypoxanthin (m/z 135,0), N-Acetyl-L-Asparaginsäure (m/z 174,0), Arachidonsäure (m/z 303,2) und mehrere Lipide wie Lysophosphatidylethanolamin LPE (18:1) (m/z 478,3), LPE(20:4) (m/z 500,3), LPE (22:6) (m/z 524,3), Phosphatidylethanolamin PE (44:10) (m/z 838,5), Phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885,6) sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Abbildung 1. Workflow der MALDI- Time of Flight (TOF) Massenspektrometrie-Bildgebung. Das schnappgefrorene Gewebe wird im Kryostaten kryrosektioniert und auf einem ITO-Objektträger montiert. → Der Objektträger mit Gewebeschnitten wird mit einer feinen Matrixschicht mit einem automatischen Matrixsprüher beschichtet. → Massenspektren werden vom MALDI-TOF MSI-Instrument an einem Raster von 20-200um gesammelt. → Die Daten werden analysiert und die Bilder werden mit der fortschrittlichen MALDI MSI-Datenanalysesoftware generiert. Maßstabsleiste: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Abbildung 2. Repräsentativer Output mit ausgewählten m/z-Spektren aus der Massenspektrometrie bei 50 μm lateraler Auflösung. (A) Eine Heatmap zeigt die räumliche Verteilung spezifischer Metabolitenspezies, die aus jedem 100-Dalton-m/z-Intervall über die drei bei P1, P21 und P60 identifizierten Entwicklungsmeilensteine ausgewählt wurden. (B) Die räumliche Verteilung repräsentativer Metaboliten bei P1, P21 und P60, einschließlich: Hypoxanthin, N-Acetyl-L-Asparaginsäure, Arachidonsäure und verschiedene Lipidspezies wie Lysophosphatidylethanolamin (LPE), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI). Maßstabsleiste, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K Aufrufe.  The City University of New York. Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen. 

Serie: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Untersuchung von Metaboliten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wurzelknöllchen

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...