Ye He e Rinat Abzalimov sono supportati dal Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen e Kelly Veerasammy sono supportati dal programma di ricerca universitario estivo CUNY della Alfred P. Sloan Foundation.

Il protocollo segue le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Advanced Science Research Center (ASRC) della City University of New York (CUNY).
1. Raccogli il tessuto
<ol><li>Preparare la barca in alluminio. Preparare un rettangolo di alluminio 10cm x 20 cm, piegare al centro per fare 10 cm quadrato a doppio strato. Etichettare le informazioni del campione su un lato e piegare l'altro lato per formare una barca con una superficie inferiore di circa 4 cm x 4 cm.</li>
	<li>Preraffreddare la barca sull'azoto liquido (LN2) in una scatola di polistirolo. NOTA: Se la barca è troppo piccola, il campione potrebbe cadere dalla barca e diventare troppo congelato contattando direttamente LN2, il che potrebbe causare frammentazione durante la criosezione.</li>
	<li>Eutanasizzare l'animale per lussazione cervicale seguendo le linee guida istituzionali IACUC, sezionare immediatamente il tessuto di interesse.<ol>
<li>Mantenere l'intervallo tra l'anestesia animale e il congelamento a scatto il più breve possibile, per ridurre al minimo l'alterazione dei metaboliti durante la raccolta dei tessuti, in particolare i metaboliti labiali nel cervello a causa dell'ischemia post-mortem. NOTA: La perfusione dell'animale con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) aumenterà la durata dell'ischemia, alterando ulteriormente le concentrazioni di metaboliti labili ed esagerando i risultati artefatti. Pertanto, la perfusione o il lavaggio del tessuto con PBS non è raccomandato, a meno che la contaminazione del sangue o del fluido corporeo non sia più interessata del deterioramento dei metaboliti o del washout per singolo progetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare immediatamente il tessuto nella barca di alluminio che galleggia su azoto liquido, chiudere il coperchio della scatola di polistirolo e congelare per 2-10 minuti a seconda delle dimensioni del tessuto: 2 minuti, 5 minuti, 7 minuti per il giorno 1 postnatale (P1), P21, cervello di topo P60, rispettivamente, e 10 minuti per il cervello di ratto P60. NOTA: Non congelare il tessuto per un tempo prolungato (ad esempio, 5 minuti per il cervello del topo P1) poiché l'eccessivamente congelato potrebbe portare alla frammentazione dei tessuti durante la criosezione.</li>
	<li>Rimuovere la barca con una pinze, piegare la lamina per avvolgere il tessuto, trasportare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C per un uso successivo. Se seguito da un sezionamento immediato, portare i campioni su ghiaccio secco al criostato. NOTA: Per preservare meglio i metaboliti, si preferisce conservare il campione in tessuto intatto e sezionarlo subito prima di procedere all'imaging MALDI. Il tessuto può essere conservato a -80 °C per un massimo di 24 mesi.</li>
</ol>2. Criosezione del tessuto
NOTA: indossare guanti in ogni momento quando si maneggiano i vetrini di tinoxuro di indio (ITO). Evitare la respirazione diretta sul vetrino o indossare maschere (opzionali) per prevenire la contaminazione della saliva umana sulla sezione del tessuto.
<ol><li>Prima di sezionare il tessuto, raccogliere il numero desiderato di vetrini rivestiti ITO compatibili MALDI.</li>
	<li>Testare la conduttività della slitta utilizzando un voltmetro impostato sulla resistenza. Etichettare il lato in cui viene letta una misurazione della resistenza: questo sarà il lato a cui aderiscono le sezioni di tessuto. Posizionare sempre la diapositiva su un tovagliolo di carta pulito per evitare contaminazioni.</li>
	<li>Pre-raffreddare i vetrini in un criostato impostato a -20 °C.</li>
	<li>Se i campioni di tessuto sono stati rimossi da -80 °C, lasciare che il tessuto si equilibra nella camera criostatica per circa 45-60 minuti a seconda delle dimensioni del tessuto. Se i campioni vengono rimossi dal ghiaccio secco, equilibrarlo per circa 30 minuti.</li>
	<li>Pulire accuratamente il criostato con il 70% di etanolo. Pre-raffreddare tutti gli strumenti necessari, tra cui pennello d'artista a punta sottile e pinna nella camera criostata.</li>
	<li>Impostare la temperatura della camera criostata e della testa del campione in base al tipo di tessuto: -14 °C per il fegato, -20 °C per il muscolo e -25 °C per la pelle9.</li>
	<li>Montare il tessuto sul mandrino utilizzando il composto di incorporamento criossutale OCT, evitando OCT dalla regione di interesse.</li>
	<li>Posizionare una lama pulita nel palco e bloccare. Regolare la posizione del palco e l'angolo del campione per ottenere l'angolo di taglio desiderato. NOTA: se devono essere tagliati diversi tipi/genotipi di tessuto, assicurarsi di riposizionare il campione in modo da utilizzare una parte pulita della lama o passare a una nuova lama prima di tagliare il campione successivo per evitare contaminazioni incrociate.</li>
	<li>Continuare a tagliare fino a quando non viene trovata la regione di interesse (ad esempio, il corpo calloso nel cervello). Assicurati di mantenere pulito il palco spazzolando via pezzi extra con un pennello d'artista che è stato bilanciato nel criostato.</li>
	<li>Una volta rivelata la regione desiderata, tagliare sezioni più piccole di 10-12 μm di spessore. Se la sezione tende a sfaldarsi o a sfaldarsi facilmente, aumentare la temperatura del criostato, rimanendo nell'intervallo da -22 °C a -11 °C. Abbiamo scoperto che la temperatura di taglio ottimale per il tessuto cerebrale è da -15 °C a - 18 °C.</li>
	<li>Una volta tagliata una buona sezione, aderisci alla slitta ITO (opera nella camera criostata).</li>
	<li>Trasferire una sezione del tessuto su vetrini ITO utilizzando la punta del pennello dell'artista.</li>
	<li>Riscaldare la sezione posizionando un dito sotto la diapositiva per riscaldare la sezione per garantire un montaggio sicuro. La sezione tissutale diventerà prima trasparente in 5-10 s e poi diventerà opaca in circa 30-60 s.</li>
	<li>Mettere da parte con attenzione la diapositiva nel criostato.</li>
	<li>Ripetere i passaggi per altri campioni di tessuto, assicurandosi che ogni sezione del tessuto sia posizionata uniformemente sul vetrino e sia il più allineata possibile.</li>
	<li>Poiché il target MALDI può contenere fino a due diapositive, posizionare le sezioni di più campioni della stessa coorte su una singola diapositiva o su due diapositive, per garantire che possano essere analizzate contemporaneamente.</li>
	<li>Al termine, posizionare le diapositive ITO in una scatola sottovuoto e trasferirle in un essiccatore con essiccante. Asciugare sottovuoto il vetrino per 45-60 min. NOTA: Se un essiccatore sottovuoto non è disponibile in laboratorio, tenere i vetrini sotto i -20 °C per tutto il tempo per evitare il deterioramento dei metaboliti.</li>
	<li>Stoccaggio e spedizione dei vetrini: a meno che il campione non sia preparato dalle strutture principali di imaging MALDI per procedere direttamente all'imaging MALDI, conservare i vetrini a -80 °C o spedirlo alle strutture principali o ad altri laboratori di ricerca MALDI su ghiaccio secco.</li>
	<li>Per preservare al meglio i campioni, posizionare i vetrini nel trasportatore di diapositive, riempirlo di azoto (opzionale), sigillare con parafilm, metterlo in un sacchetto con cerniera, che viene quindi inserito in un altro sacchetto con cerniera contenente essiccante. Etichettare il sacchetto esterno con zip.</li>
	<li>Procedere allo stoccaggio a -80 °C (fino a 6 mesi) o alla spedizione con ghiaccio secco adeguato.</li>
</ol>3. Preparazione della matrice
<ol><li>Preparare la matrice. NOTA: Tutti i reagenti devono essere di grado HPLC.<ol>
<li>Preparare NEDC ad una concentrazione di 10 mg/ml. Preparare 10 ml di matrice disciolta in un solvente al 70% di metanolo (100 mg di NEDC, 7 ml di metanolo, 3 ml di H2O).</li>
		<li>Preparare inoltre un extra di 10 ml di metanolo al 70%: soluzione acquosa per lavare il sistema di spruzzatura prima di riempire la matrice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta disidratate le diapositive nel passaggio 2.17, posizionare i segni "X" sullo spazio vuoto del vetrino al di fuori delle sezioni di tessuto utilizzando un pennarello in argento a punta in grassetto, quindi posizionare una seconda "x" con un pennarello nero a punta fine sopra la "X" d'argento. La "X" nera con un netto contrasto fuori dallo sfondo argentato (la "X" in grassetto d'argento) servirà in seguito come marcatore fiduciario per la successiva acquisizione di spettri di massa nello strumento MALDI.</li>
	<li>Caricare la diapositiva nel target metallico della diapositiva MALDI. Usa una copertura di plastica e disegna / delinea dove i campioni si trovano sul coperchio di plastica. Accantonare.</li>
	<li>Scansiona l'immagine della diapositiva insieme al target MALDI utilizzando lo scanner piano. Le viti sulla superficie del bersaglio fungeranno da distanziatore per prevenire il danneggiamento o la contaminazione della sezione tissutale da parte dello scanner. Visualizza in anteprima ed esegui la scansione dell'area di scorrimento selezionata in scala di grigi a 16 bit e 2400 dpi. Salvare l'immagine per un uso successivo in MALDI MSI.</li>
</ol>4. Deposizione della matrice
NOTA: Esistono diversi metodi per applicare uno strato uniforme di matrice in dimensioni di cristallo fine sulla diapositiva MALDI, tra cui sublimazione, stampa a getto d'inchiostro a goccia, spruzzatore automatico a matrice e spray manuale utilizzando artist airbush9. Useremo lo spruzzatore a matrice automatica come esempio in questo protocollo per la sua elevata riproducibilità.
<ol><li>Avvio: accendere l'unità spruzzatrice a matrice, assicurandosi che la valvola sia posizionata a LOAD e avviare il software dello spruzzatore. Controllare che la ventola di scarico funzioni bene. Non avviare la pompa del solvente se lo sfiato attivo non funziona correttamente.</li>
	<li>Confermare nella scheda Comunicazione che tutto stia comunicando, quindi avviare la pompa del solvente a .1 mL / min, con una contropressione di ~ 500 psi (o 3,4 MPa).</li>
	<li>Avviare il flusso di aria compressa allo spruzzatore a matrice impostando il serbatoio dell'azoto a 30 psi. Quindi, regolare il regolatore di pressione sulla parte anteriore dello spruzzatore a 10 psi e impostare la temperatura dell'ugello dello spruzzatore come desiderato. NOTA: Se la pressione dell'aria in preghiera è inferiore a 5 psi, l'ugello dello spruzzatore non sarà in grado di riscaldarsi per protezione.</li>
	<li>Con la valvola ancora in posizione LOAD, utilizzare una siringa per lavare l'anello con 7 ml di metanolo al 70%, quindi riempire il ciclo con 6 mL di matrice.</li>
	<li>Posizionare i vetrini di tessuto nei supporti dello spruzzatore, nastrando entrambe le estremità per impedire il movimento e per preservare un bordo privo di matrice per evitare la contaminazione del morsetto metallico sul bersaglio MALDI da parte della matrice. NOTA: Si consiglia vivamente di testare lo spray a matrice su un vetrino per microscopio bianco prima di procedere a preziosi vetrini campione.</li>
	<li>Controllare che la portata e la temperatura siano stabili per iniziare la spruzzatura.</li>
	<li>Selezionare il metodo desiderato pre-testato utilizzando un vetrino vuoto.</li>
	<li>Premere Start. Questo regolerà la temperatura dell'ugello e regolerà la portata della pompa in modo che corrisponda al metodo selezionato. Commutare la valvola dalla posizione Carico a Quella Spruzzo, quindi confermare facendo clic su Continua.</li>
	<li>Consentire l'esecuzione del sistema, che richiederà 5-20 minuti per diapositiva a seconda del metodo. Spostare la valvola dalla posizione Spray alla posizione Load, quindi confermare facendo clic su Continua al termine.</li>
	<li>Rimuovere i vetrini dallo spruzzatore, esaminare il modello di rivestimento della matrice al microscopio per garantire uno strato uniforme di cristallo a matrice fine.</li>
	<li>Dopo la deposizione della matrice, posizionare le diapositive nel supporto MALDI metallico per un uso immediato. Se è presente un solo vetrino campione, aggiungere un'altra diapositiva vuota per riempire i due spazi del supporto MALDI.</li>
	<li>Pulire il sistema immediatamente dopo l'uso seguendo le istruzioni del produttore, per evitare l'intasamento dell'ugello dello spruzzatore.</li>
	<li>Dopo che il vetrino del campione è stato rivestito con matrice, procedere immediatamente allo strumento di imaging MALDI o spedirlo con ghiaccio secco utilizzando la stessa preparazione a doppia cerniera descritta nel passaggio 2.19. NOTA: In circostanze di emergenza come lo strumento MALDI non è disponibile per l'uso immediato, conservare il vetrino rivestito sotto vuoto o a -20 °C per un massimo di 24 ore, anche se il deterioramento di alcuni metaboliti potrebbe verificarsi durante lo stoccaggio, che non è stato studiato a fondo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflow+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+analysis+of+the+heart.">Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+Measurement:+Pitfalls+to+Avoid+and+Practices+to+Follow.">Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. 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A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Hankin, J. A., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+MALDI+IMS+intensity+and+measured+quantity+of+selected+phospholipids+in+rat+brain+sections.">Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections.</a> Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).</li><li>Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) è una tecnica di imaging label-free che consente ai ricercatori di studiare la distribuzione di varie biomolecole e le loro modificazioni nei tessuti, la base molecolare della patologia. L'uso combinato di MALDI-MSI con i tradizionali approcci LC-MS per l'analisi dei tessuti fornisce la stessa profondità molecolare dei flussi di lavoro Omics tradizionali, ma che mantiene anche la relazione spaziale di tali segnali all'interno della rete cellulare. La preparazione del campione è la fase più critica in MALDI MSI e tiene conto della variazione delle lette finali degli studi di metabolomica condotti in diversi laboratori4. Qui forniamo un protocollo completo ma pratico per standardizzare la preparazione del campione per la profilazione metabolomica utilizzando MALDI MSI, nella speranza che sia vantaggioso per un'ampia comunità di ricerca implementare MALDI MSI nella loro ricerca attuale e futura dalla biologia di base agli studi traslazionali.
Bisogna sempre tenere a mente tutte le precauzioni per ridurre al minimo i cambiamenti nei profili molecolari (sia abbondanza che distribuzione spaziale) durante la preparazione del campione ed evitare la contaminazione. In primo luogo, ridurre al minimo il tempo tra l'eutanasia animale e la raccolta dei tessuti, come congelati in situ o riscaldati dalla fissazione a microonde per inattivare gli enzimi nel cervello per ridurre la responsabilità per l'ischemia post mortem4,5,6. In secondo luogo, la condizione di congelamento a scatto del campione è critica. Un congelamento inadeguato causerà la degradazione e la perdita dei metaboliti, mentre il congelamento eccessivo porterà alla frammentazione dei tessuti durante la criosezione. Il tempo di congelamento dovrebbe sempre essere testato prima secondo i precedenti studi riportati, e lo studio del cervello di topo dello sviluppo presentato in questo documento fornisce i punti di riferimento per il tessuto cerebrale dei roditori. In terzo luogo, il taglio dei tessuti biologici e il trasferimento delle loro sezioni ai vetrini ITO richiederanno una pratica adeguata. È importante notare che mentre si utilizza il pennello per raccogliere la sezione dal palco, il pennello deve essere usato delicatamente. Lasciare che le setole della spazzola entrino in contatto solo con i bordi della sezione tissutale per ridurre il rischio di contaminazione e frammentazione della sezione. Appiattire il più possibile la sezione sulla diapositiva, questo impedirà l'arricciamento della sezione durante il riscaldamento delle dita. In quarto luogo, durante il montaggio sulla diapositiva ITO, assicurarsi che l'intera sezione sia ben collegata alla diapositiva ITO poiché diverse regioni del tessuto potrebbero richiedere un tempo diverso di riscaldamento delle dita. Ad esempio, il tessuto tumorale cerebrale richiede un tempo di riscaldamento più lungo rispetto al normale tessuto cerebrale. Un montaggio scadente potrebbe portare al distacco e alla frammentazione del tessuto durante la scansione MALDI-MS. Tieni presente che il riscaldamento delle dita potrebbe consentire l'azione enzimatica e il metabolismo causando cambiamenti artefatti dei metaboliti. In quinto luogo, una deposizione fine e uniforme della matrice MALDI svolge un ruolo importante nel raggiungimento di informazioni spaziali accurate e di un forte segnale MALDI-MS. Si consiglia di testare la spruzzatura della matrice su un vetrino bianco e osservare il modello cristallino al microscopio per verificare la corretta copertura, prima di procedere al rivestimento del prezioso vetrino del campione. E infine, poiché un singolo ricercatore esegue la raccolta dei tessuti e la preparazione del vetrino a velocità diverse, sarebbe ideale avere una persona che gestisca la preparazione del campione per il campione nella stessa coorte, per ridurre al minimo la variazione.
Il protocollo fornito sopra dettaglia le procedure standard, che possono essere adattate alle esigenze di particolari esperimenti. Ad esempio, un OCT gel criosezionante, che viene normalmente utilizzato nella criosezione del campione, può essere ulteriormente utilizzato come colla di montaggio al mandrino del tessuto (come nello studio sopra descritto). Studi precedenti hanno dimostrato che il componente polimerico in OCT provoca una forte soppressione degli ioni14. Tuttavia, l'incorporamento del campione può essere inevitabile nei casi in cui il tessuto è troppo fragile per essere tagliato senza ulteriore supporto da un gel polimerico. Al fine di combattere la soppressione del segnale in questi casi, potrebbe essere necessario lavare i tessuti con lavaggio seriale in etanolo al 70% etanolo al 95% per rimuovere l'OCT residuo per la rilevazione di proteine o lipidi, mentre il lavaggio non è raccomandato per la rilevazione di piccoli metaboliti molecolari9.
MALDI MSI è diventato sempre più rilevante sia nel laboratorio di ricerca che nella pratica clinica. Ad esempio, MALDI MSI si è recentemente dimostrato utile negli studi di proteomica al fine di caratterizzare lo stato funzionale fenotipico di un organismo15e nell'agire come agente per l'identificazione microbica e la diagnosi della successiva malattia16. Mentre MALDI MSI supporta una vasta gamma di applicazioni, ci sono alcune limitazioni associate all'affidarsi esclusivamente a questa tecnica, specialmente quando si tratta di differenziare tra specie o metaboliti simili e l'identificazione di bersagli specifici. Un'altra sfida è la quantificazione della concentrazione dei metaboliti secondo i segnali MALDI MSI. Si presume spesso che le abbondanze di ioni negli spettri MALDI MSI e la distribuzione spaziale (o abbondanza relativa) delle corrispondenti specie molecolari tra i tessuti sezionati siano ben correlate. Tuttavia, si dovrebbe sempre tenere presente che la relazione tra l'intensità degli ioni e la quantità di specie molecolari corrispondenti è complicata da numerosi fattori tra cui, ma non solo, gli effetti della soppressione degli ioni, i cambiamenti nella struttura tissutale e le reazioni ione-molecola17. Le tecniche che fanno uso di standard interni possono essere implementate per la quantificazione assoluta (tessuto μmol/g) in MALDI-MSI18. Queste due sfide sono tipicamente affrontate con il flusso di lavoro combinato di MALDI MSI con tecniche di cromatografia liquida tandem MS (LC-MS / MS), in cui MALDI-MS consente la mappatura della regione di interesse, che viene successivamente sottoposta a microestrazione e LC-MS / MS per fornire maggiori informazioni per identificare il metabolita19.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di imaging basati sulla SM come modalità alternativa alle tecniche precedenti per l'imaging di metaboliti di piccole molecole. Con i progressi e la crescente popolarità di MALDI MSI, si prevede che l'imaging MALDI diventerà un nuovo strumento standard per la visualizzazione di piccole molecole. Di particolare interesse sono l'imaging di piccole molecole lipidiche ed endogene (ad es. neurotrasmettitori e metaboliti) in ambito biologico, nonché l'imaging di xenobiotici per lo sviluppo di nuovi agenti farmaceutici. Queste tre aree dovrebbero avere rapidi progressi con l'applicazione di MALDI MSI nel prossimo futuro20.

I metaboliti, gli intermedi o i prodotti finali del metabolismo, compresi i nucleotidi, gli amminoacidi o gli acidi organici, i lipidi, sono componenti chiave delle funzioni e dei processi biologici. La metabolomica, lo studio dei metaboliti, consente l'esplorazione delle loro interazioni biochimiche e la comprensione dei loro ruoli nel contesto della ricerca di base, traslazionale e clinica. I metaboliti sono fortemente associati ai fenotipi degli organismi e forniscono informazioni sulle attività biochimiche che si verificano durante il metabolismo cellulare1. Pertanto, oltre alla genomica e alla proteomica, la metabolomica è emersa come uno strumento importante per comprendere sia le condizioni fisiologiche che patologiche. Ad esempio, la metabolomica viene utilizzata per chiarire i meccanismi alla base dei farmaci esistenti e la loro tolleranza. Nello sviluppo di farmaci, il metabolismo xenobiotico è utile per valutare l'attività o la tossicità dei metaboliti tra le specie, che in seguito si traduce nel sostenere la medicina personalizzata2. Nonostante l'ampia applicazione della metabolomica, l'imaging dei metaboliti può essere difficile a causa della reattività chimica dei metaboliti, dell'eterogeneità strutturale e dell'ampio intervallo di concentrazione3. Tuttavia, le concentrazioni di metaboliti labili tra cui composti ad alta energia, glucosio, lattato, glicolitico, via di shunt del pentoso e intermedi del ciclo TCA, fosfolipidi, neurotrasmettitori, composti di segnalazione, possono cambiare in pochi secondi e progredire in pochi minuti quando gli enzimi tissutali sono attivi durante le procedure di raccolta dei tessuti, come l'ischemia post mortem nella raccolta cerebrale4,5,6 . Per garantire un'accurata acquisizione dei dati metabolomici, è fondamentale un'adeguata e attenta preparazione del campione7,8. Le attuali piattaforme stabilite per la misurazione dei metaboliti includono NMR, saggi enzimatici e spettrometria di massa (compresa la cromatografia liquida e gassosa), l'ultima delle quali è discussa più avanti.
MALDI-MSI è una tecnica all'avanguardia che consente l'analisi di campioni complessi attraverso la rilevazione di singole specie molecolari. MALDI MSI garantisce il vantaggio di poter misurare in modo rapido e riproducibile vari composti molecolari in campioni biologici. L'imaging con spettrometria di massa consente inoltre la produzione di immagini che rappresentano la biologia tissutale basata sui suoi metaboliti compositi, e lo fa preservando la distribuzione spaziale dei metaboliti nel campione9. La capacità di MALDI di rilevare analiti in un campione senza l'uso di etichettatura anticorpale, modifiche strutturali o altri reagenti specializzati, come quelli utilizzati nell'immunostaining, insieme alla sua capacità di monitorare centinaia di molecole all'interno di un singolo esperimento comprendono solo alcuni dei vantaggi che l'imaging MS garantisce quando si tratta di profilazione metabolica10, 11. Oltre alla matrice comunemente usata come l'acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e la 9-aminoacridina (9-AA), recentemente scoperta una nuova matrice N -(1-Naftil) Etilendiammina Dicloridrato (NEDC), che è adatta per l'analisi di vari metaboliti a basso peso molecolare, ha ulteriormente migliorato l'applicazione di MALDI MSI nel profilo metabolico12.
Nonostante l'ampia applicazione di MALDI MSI, l'elevato costo dello strumento e la complessità della procedura sperimentale ne impediscono una più ampia implementazione nei singoli laboratori di ricerca. Pertanto, la maggior parte degli studi MALDI MSI sono supportati attraverso strutture di base condivise. La preparazione del campione, compresa la preparazione del vetrino e il rivestimento della matrice, è la fase più critica in MALDI MSI. Tuttavia, la preparazione del vetrino viene normalmente eseguita nel laboratorio del singolo ricercatore, il che crea potenziali variazioni nella successiva acquisizione di MALDI MSI. Qui miriamo a fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del campione di campioni biologici prima di procedere alle misurazioni MALDI MSI e utilizzare un profilo metabolomico del cervello del topo in via di sviluppo come esempio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

La metabolomica, lo studio per identificare e quantificare piccole molecole e metaboliti presenti in un campione sperimentale, è emersa come uno strumento importante per indagare le attività biologiche durante lo sviluppo e le malattie. Gli approcci metabolomici sono ampiamente utilizzati nello studio del cancro, della nutrizione / dieta, del diabete e di altre condizioni fisiologiche e patologiche che coinvolgono i processi metabolici. Uno strumento vantaggioso che aiuta nella profilazione metabolomica sostenuta in questo articolo è il desorbimento laser assistito da matrice / spettrometria di massa a ionizzazione (MALDI MSI). La sua capacità di rilevare metaboliti in situ senza etichettatura, modifiche strutturali o altri reagenti specializzati, come quelli utilizzati nell'immuno colorazione, rende MALDI MSI uno strumento unico nell'avanzamento di metodologie rilevanti nel campo della metabolomica. Un processo di preparazione del campione appropriato è fondamentale per ottenere risultati ottimali e sarà al centro di questo documento.

L'esperimento rappresentativo è stato eseguito in base al flusso di lavoro illustrato nella Figura 1. I cervelli di topo wildtype C57BL in via di sviluppo dei giorni postnatali 1, 21, 60 (adulti) sono stati raccolti come descritto sopra seguendo le linee guida CUNY IACUC e sono stati congelati a scatto per 2, 5 e 7 minuti, rispettivamente, su una barca di alluminio che galleggia su azoto liquido. I tessuti congelati sono stati criosezionati a sezioni di spessore di 10 μm a -15 °C impostate sia per la testa del campione che per la camera. Le criosezioni tissutali sono state quindi trasferite delicatamente sul lato conduttivo pre-raffreddato dei vetrini rivestiti itO per l'imaging MALDI. Le criosezioni montate su vetrini ITO sono state essiccate sotto vuoto per 45 minuti a temperatura ambiente, seguite dalla deposizione della matrice utilizzando lo spruzzatore automatico a matrice. La matrice NEDC è stata utilizzata per rilevare i metaboliti e una soluzione di matrice di 10 mg/mL in metanolo/acqua (70/30, v/v) è stata depositata a una portata di 0,1 ml/min e una temperatura dell'ugello di 75 °C per 12 cicli con 5 s di essiccazione tra ogni ciclo. È stata utilizzata una velocità di spruzzatura di 1300 mm/min, una spaziatura del binario di 2 mm,una pressione del gas N 2 di 10 psi e una portata di 3 L/min e un'altezza dell'ugello di 40 mm.
Gli spettri di massa MALDI sono stati acquisiti in modalità ioni negativi dallo strumento MALDI time of flight (TOF) MSI. 0,5-1 μL di emulsione di fosforo rosso (gruppi Pn con n = 1 - 90) in metanolo sono stati depositati sui vetrini ITO, accanto ai tessuti montati, e utilizzati per calibrare lo strumento nell'intervallo di massa 100 - 1000 m/z applicando la curva di calibrazione quadratica13. I diametri dello spot laser sono stati focalizzati su un profilo del fascio modulato "Medio" per una larghezza raster di 50 μm. Spettri all'interno della gamma di massa da m/ z 50 a 1000 sono stati acquisiti a 1000 Hz per 500 colpi. Sono stati registrati i dati degli spettri di massa e l'imaging è stato ulteriormente analizzato utilizzando il software avanzato di analisi dei dati MALDI MSI. Le immagini ioniche sono state generate con normalizzazione RMS (root-mean square) a una larghezza del bin di ±0,25 Da.
I risultati nella Figura 2 mostrano le immagini di output del software di analisi dei dati MALDI MSI di spettri m/z selezionati ogni intervallo di 100 Dalton, che descrivono chiaramente l'utilità per l'identificazione degli spettri dai metaboliti di piccole molecole ai lipidi ad alto peso molecolare. Ogni riga raffigura le rispettive mappe di calore ioiche contenenti informazioni spaziali e spettrali di una determinata specie di metaboliti attraverso tre tessuti raccolti ai giorni postnatali 1, 21 e 60. Per ogni m/z rappresentativo, l'analisi della distribuzione regionale e delle abbondanze di ioni può essere utilizzata per confrontare le quantità relative delle specie corrispondenti tra le diverse età. Un punto di forza della metodologia MALDI MSI è la capacità di discernere la specificità di alcune specie identificate da m/z a tappe dello sviluppo o a specifiche strutture anatomiche. Si osserva che alcuni metaboliti sono arricchiti nei neonati P1 (m/z 320,1), arricchiti negli adulti P60 (m/z 846,5) o distribuiti uniformemente tra le età (m/z 480,3); altre specie molecolari sono specificamente arricchite in materia grigia (m/z 117.1; 524.3; 765.1), sostanza bianca (m/z 673.4; 846.5) o CSF/ventricoli (m/z 239.0) (Figura 2A). Viene inoltre mostrata la distribuzione spaziale di metaboliti rappresentativi tra cui ipoxantina (m/z 135.0), acido N-acetil-L-aspartico (m/z 174.0), acido arachidonico (m/z 303.2) e diversi lipidi come lisofosfatidilethanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidiletanolammina PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidilinositolo PI(38:4) (m/z 885.6) (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Figura 1. Flusso di lavoro dell'imaging della spettrometria di massa MALDI- time of flight (TOF). Il tessuto congelato a scatto viene criosciotto in criostato e montato su vetrino ITO. → Il vetrino con sezioni di tessuto è rivestito con un sottile strato di matrice utilizzando uno spruzzatore automatico a matrice. → spettri di massa sono raccolti dallo strumento MALDI-TOF MSI ad un raster di 20-200um. → I dati vengono analizzati e le immagini vengono generate utilizzando il software avanzato di analisi dei dati MALDI MSI. Barra della scala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Figura 2. Uscita rappresentativa con spettri m/z selezionati dalla spettrometria di massa acquisita a risoluzione laterale di 50 μm. (A) Una mappa termica raffigura la distribuzione spaziale di specifiche specie di metaboliti selezionati da ogni intervallo di 100 Dalton m/z attraverso le tre tappe dello sviluppo identificate a P1, P21 e P60. (B) La distribuzione spaziale di metaboliti rappresentativi a P1, P21 e P60, tra cui: ipoxantina, acido N-acetil-L-aspartico, acido arachidonico e diverse specie lipidiche come lisofosfatidilethanolamine (LPE), fosfatidilfetanolammina (PE), fosfatidilinositolo (PI). Barra della scala, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla preparazione del campione quando si pianificano esperimenti utilizzando MALDI MSI per massimizzare il rilevamento metabolico e molecolare in campioni biologici.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

5.9K Views.  The City University of New York. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla preparazione del campione quando si pianificano esperimenti utilizzando MALDI MSI per massimizzare il rilevamento metabolico e molecolare in campioni biologici. 

Video: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio &amp; massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...