Ye He y Rinat Abzalimov cuentan con el apoyo del Programa de Premios de Investigación del Congreso del Personal Profesional-Universidad de la Ciudad de Nueva York (PSC-CUNY). Yuki Chen y Kelly Veerasammy cuentan con el apoyo del Programa de Investigación de Pregrado de Verano de la Fundación Alfred P. Sloan CUNY.

El protocolo sigue las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Investigación científica avanzada (ASRC) de la Universidad de la Ciudad de Nueva York (CUNY).
1. Cosecha el tejido
<ol><li>Prepara el bote de aluminio. Prepara un rectángulo de aluminio de 10cm x 20 cm, dobla en el medio para hacer cuadrados de doble capa de 10 cm. Etiquete la información de la muestra en un lado y doble el otro lado para formar un bote con una superficie inferior de aproximadamente 4 cm x 4 cm.</li>
	<li>Preenfóque el barco en el nitrógeno líquido (LN2)en una caja de espuma de poliestireno. NOTA: Si el bote es demasiado pequeño, la muestra puede caerse del bote y congelarse al contactar directamente con LN2,lo que puede resultar en fragmentación durante la crioseccionamiento.</li>
	<li>La eutanasia del animal por luxación cervical siguiendo las pautas institucionales de la IACUC, disecciona inmediatamente el tejido de interés.<ol>
<li>Mantenga el intervalo entre la anestesia animal y la congelación instantánea lo más corto posible, para minimizar la alteración de los metabolitos durante la recolección de tejidos, especialmente los metabolitos labiales en el cerebro debido a la isquemia postmortem. NOTA: La perfusión del animal con solución salina tamponada con fosfato (PBS) aumentará la duración de la isquemia, alterando aún más las concentraciones de metabolitos lábiles y exagerando los resultados artificiosos. Por lo tanto, no se recomienda la perfusión o el lavado del tejido con PBS, a menos que la contaminación de la sangre o el fluido corporal sea más preocupante que el deterioro o lavado de metabolitos para el proyecto individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque inmediatamente el tejido en el bote de aluminio que flota en nitrógeno líquido, cierre la tapa de la caja de espuma de poliestireno y congele durante 2-10 minutos dependiendo del tamaño del tejido: 2 min, 5 min, 7 min para el día postnatal 1 (P1), P21, P60 cerebro de ratón, respectivamente, y 10 min para cerebro de rata P60. NOTA: No congele el tejido durante un tiempo prolongado (por ejemplo, 5 minutos para el cerebro de ratón P1) ya que el sobrecongelado podría provocar la fragmentación del tejido durante la crioseccionación.</li>
	<li>Retire el bote con fuerceps, doble la lámina para envolver el tejido, transporte sobre hielo seco y guárdelo a -80 °C para su uso posterior. Si le sigue una seccionamiento inmediato, lleve las muestras sobre hielo seco hasta el criostato. NOTA: Para preservar mejor los metabolitos, se prefiere almacenar la muestra en tejido intacto y seccionarla justo antes de proceder a la imagen MALDI. El tejido se puede almacenar en -80 °C durante un plazo de hasta 24 meses.</li>
</ol>2. Criosectación del tejido
NOTA: Use guantes en todo momento cuando manipule los portaobjetos de tinóxido de indio (ITO). Evite la respiración directa en el portaobjetos o use máscaras (opcional) para evitar la contaminación de la saliva humana en la sección de tejido.
<ol><li>Antes de seccionar el tejido, reúna el número deseado de portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO compatibles con MALDI.</li>
	<li>Pruebe la conductividad de la corredera con un voltímetro ajustado a la resistencia. Etiquete el lado donde se lee una medición de resistencia: este será el lado al que se adhieren las secciones de tejido. Siempre coloque el tobogán sobre una toalla de papel limpia para evitar la contaminación.</li>
	<li>Enfríe previamente las diapositivas en un criostato ajustado a -20 °C.</li>
	<li>Si se extrajeron muestras de tejido de los -80 °C, deje que el tejido se equilibre en la cámara de criostato durante unos 45-60 minutos, dependiendo del tamaño del tejido. Si las muestras se están retirando del hielo seco, equilibre durante unos 30 minutos.</li>
	<li>Limpie a fondo el criostato con etanol al 70%. Enfríe previamente todas las herramientas necesarias, incluido el pincel de artista de punta delgada y las forrcepciones en la cámara del criostato.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de la cámara criostato y la cabeza de la muestra según el tipo de tejido: -14 ° C para el hígado, -20 ° C para el músculo y -25 ° C para la piel9.</li>
	<li>Monte el tejido en el mandril utilizando el tejido criostático que incrusta el compuesto OCT, evitando la OCT de la región de interés.</li>
	<li>Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquee. Ajuste la posición del escenario y el ángulo de la muestra para lograr el ángulo de corte deseado. NOTA: Si se van a cortar diferentes tipos/genotipos de tejido, asegúrese de reposicionar la muestra para que se use una parte limpia de la cuchilla o cambiar a una cuchilla nueva antes de cortar la siguiente muestra para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Continúe cortando hasta que se encuentre la región de interés (por ejemplo, el cuerpo calloso en el cerebro). Asegúrese de mantener el escenario limpio cepillando las piezas adicionales con un pincel de artista que se haya equilibrado en el criostato.</li>
	<li>Una vez que se revela la región deseada, corte secciones más pequeñas de 10-12 μm de espesor. Si la sección tiende a desprenderse o desmoronarse fácilmente, eleve la temperatura del criostato, manteniéndose en el rango de -22 °C a -11 °C. Hemos encontrado que la temperatura de corte óptima para el tejido cerebral es de -15 ° C a - 18 ° C.</li>
	<li>Una vez cortada una buena sección, adherirla a la diapositiva ITO (operar en la cámara criostato).</li>
	<li>Transfiera una sección del tejido a las diapositivas ITO usando la punta del pincel artista.</li>
	<li>Caliente la sección con los dedos colocando un dedo debajo de la corredera para calentar la sección y garantizar un montaje seguro. La sección de tejido primero se volverá transparente en 5-10 s y luego se volverá opaca en aproximadamente 30-60 s.</li>
	<li>Aparta cuidadosamente la diapositiva en el criostato.</li>
	<li>Repita los pasos para otras muestras de tejido, asegurándose de que cada sección del tejido se coloque uniformemente en el portaobjetos y esté lo más alineada posible.</li>
	<li>Dado que el objetivo MALDI puede contener hasta dos diapositivas, coloque las secciones de varias muestras de la misma cohorte en una sola diapositiva o en dos diapositivas, para garantizar que se puedan analizar al mismo tiempo.</li>
	<li>Cuando termine, coloque las diapositivas ITO en una caja de vacío y transfiéralos a un desecador con desecante. Seque al vacío el portaobjetos durante 45-60 min. NOTA: Si un desecador de vacío no está disponible en el laboratorio, mantenga las diapositivas por debajo de -20 ° C todo el tiempo para evitar el deterioro de los metabolitos.</li>
	<li>Almacenamiento y envío de diapositivas: a menos que la muestra sea preparada por las instalaciones centrales de imágenes maldi para proceder directamente a las imágenes MALDI, almacenar las diapositivas a -80 ° C o enviar a las instalaciones centrales u otros laboratorios de investigación MALDI en hielo seco.</li>
	<li>Para preservar mejor las muestras, coloque las diapositivas en el transportador de diapositivas, llénelo con nitrógeno (opcional), selle con parafilm, colóquelo en una bolsa con cremallera, que luego se coloca en otra bolsa con cremallera que contenga desecante. Etiquete la bolsa exterior con cremallera.</li>
	<li>Proceda al almacenamiento a -80 ° C (hasta 6 meses) o al envío con hielo seco adecuado.</li>
</ol>3. Preparación de la matriz
<ol><li>Preparar la matriz. NOTA: Todos los reactivos deben ser de grado HPLC.<ol>
<li>Preparar NEDC a una concentración de 10 mg/ml. Preparar 10 mL de matriz disuelta en un disolvente de metanol al 70% (100 mg de NEDC, 7 mL de metanol, 3 mL de H2O).</li>
		<li>Además, prepare 10 ml adicionales de solución de metanol: agua al 70% para enjuagar el sistema de pulverización antes de rellenar la matriz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que las diapositivas estén deshidratadas en el paso 2.17, coloque las marcas "X" en el espacio en blanco de la diapositiva de vidrio fuera de las secciones de tejido usando un marcador plateado de punto en negrita, y luego coloque una segunda "x" con un marcador negro de punto fino en la parte superior de la "X" plateada. La "X" negra con un fuerte contraste fuera del fondo plateado (la negrita plateada "X") servirá más tarde como marcador fiduciario para la posterior adquisición de espectros de masas en el instrumento MALDI.</li>
	<li>Cargue la diapositiva en el objetivo metálico de la diapositiva MALDI. Use una cubierta de plástico y dibuje / delinee donde las muestras están en la cubierta de plástico. Reservar.</li>
	<li>Escanee la imagen de la diapositiva junto con el objetivo MALDI utilizando un escáner plano. Los tornillos en la superficie del objetivo servirán como espaciador para evitar el daño o la contaminación de la sección de tejido por parte del escáner. Obtenga una vista previa y escanee el área de diapositiva seleccionada en escala de grises de 16 bits y 2400 ppp. Guarde la imagen para su uso posterior en MALDI MSI.</li>
</ol>4. Deposición matricial
NOTA: Existen múltiples métodos para aplicar una capa uniforme de matriz en tamaño de cristal fino en la diapositiva MALDI, incluida la sublimación, la impresión de inyección de tinta de gotas, el pulverizador automático de matriz y el pulverizador manual utilizando artist airbush9. Utilizaremos el pulverizador automático de matriz como ejemplo en este protocolo por su alta reproducibilidad.
<ol><li>Arranque: Encienda la unidad de pulverización matricial, asegurándose de que la válvula esté colocada en LOAD y lance el software de pulverización. Compruebe que el ventilador de escape funciona bien. No encienda la bomba de disolvente si la ventilación activa no funciona correctamente.</li>
	<li>Confirme en la pestaña Comunicaciones que todo se está comunicando y luego inicie la bomba de solvente a .1 mL / min, con una contrapresión de ~ 500 psi (o 3.4 MPa).</li>
	<li>Inicie el flujo de aire comprimido al pulverizador de matriz configurando el tanque de nitrógeno a 30 psi. Luego, ajuste el regulador de presión en la parte frontal del pulverizador a 10 psi y ajuste la temperatura de la boquilla del pulverizador como desee. NOTA: Si la presión del aire en la oración es inferior a 5 psi, la boquilla del pulverizador no podrá calentarse para protegerse.</li>
	<li>Con la válvula todavía en la posición LOAD, use una jeringa para enjuagar el bucle con 7 ml de metanol al 70% y luego llene el bucle con 6 ml de matriz.</li>
	<li>Coloque los deslizamientos de tejido en los soportes en el pulverizador, pegando con cinta adhesiva ambos extremos para evitar el movimiento y preservar un borde libre de matriz para evitar la contaminación de la abrazadera de metal en el objetivo MALDI por la matriz. NOTA: Se recomienda encarecidamente probar el spray de matriz en un portaobjetos de microscopio en blanco antes de proceder a las preciosas diapositivas de muestra.</li>
	<li>Verifique que el caudal y la temperatura sean estables para comenzar la pulverización.</li>
	<li>Seleccione el método deseado previamente probado con una diapositiva de vidrio en blanco.</li>
	<li>Pulse Inicio. Esto establecerá la temperatura de la boquilla y ajustará el caudal de la bomba para que coincida con el método seleccionado. Cambie la válvula de la posición de carga a pulverización y luego confirme haciendo clic en Continuar.</li>
	<li>Permita que el sistema se ejecute, lo que tomará de 5 a 20 minutos por diapositiva dependiendo del método. Cambie la válvula de la posición De pulverización a Carga y luego confirme haciendo clic en Continuar cuando haya terminado.</li>
	<li>Retire la(s) diapositiva(s) del pulverizador, examine el patrón de recubrimiento de la matriz bajo el microscopio para asegurar una capa uniforme de cristal de matriz fina.</li>
	<li>Después de la deposición de la matriz, coloque la(s) diapositiva(s) en el soporte de metal MALDI para su uso inmediato. Si solo hay una diapositiva de muestra, agregue otra diapositiva en blanco para llenar los dos espacios del soporte MALDI.</li>
	<li>Limpie el sistema inmediatamente después del uso siguiendo las instrucciones del fabricante, para evitar la obstrucción de la boquilla del pulverizador.</li>
	<li>Después de recubrir el portaobjetos de muestra con matriz, proceda inmediatamente al instrumento de imágenes MALDI o envíelo con hielo seco utilizando la misma preparación de bolsa de doble cremallera descrita en el paso 2.19. NOTA: En circunstancias de emergencia, como que el instrumento MALDI no está disponible para su uso inmediato, guarde la corredera recubierta en condiciones de vacío o a -20 ° C durante un período de hasta 24 horas, aunque el deterioro de algunos metabolitos puede ocurrir durante el almacenamiento, que no se ha estudiado a fondo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) es una técnica de imagen sin etiquetas que permite a los investigadores investigar la distribución de varias biomoléculas y sus modificaciones en el tejido, la base molecular de la patología. El uso combinado de MALDI-MSI con los enfoques tradicionales de LC-MS para el análisis de tejidos proporciona la misma profundidad molecular que los flujos de trabajo ómicos tradicionales, pero también conserva la relación espacial de esas señales dentro de la red celular. La preparación de la muestra es el paso más crítico en MALDI MSI y explica la variación en las lecturas finales de los estudios de metabolómica realizados en diferentes laboratorios4. Aquí proporcionamos un protocolo completo pero práctico para estandarizar la preparación de la muestra para el perfil metabolómico utilizando MALDI MSI, con la esperanza de que beneficie a una amplia comunidad de investigación implementar MALDI MSI en sus investigaciones actuales y futuras, desde la biología básica hasta los estudios traslacionales.
Siempre hay que tener en cuenta todas las precauciones para minimizar los cambios en los perfiles moleculares (tanto de abundancia como de distribución espacial) durante la preparación de las muestras y evitar la contaminación. En primer lugar, minimizar el tiempo entre la eutanasia animal y la recolección de tejidos, como congelados in situ o calentados por fijación de microondas para inactivar enzimas en el cerebro para reducir la responsabilidad de la isquemia postmortem4,5,6. En segundo lugar, la condición de congelación instantánea de la muestra es crítica. La congelación inadecuada causará la degradación y pérdida de los metabolitos, mientras que la congelación excesiva conducirá a la fragmentación del tejido durante la criosecciona. El tiempo de congelación siempre debe probarse primero de acuerdo con estudios informados anteriormente, y el estudio del cerebro de ratón en desarrollo presentado en este documento proporciona los puntos de referencia para el tejido cerebral de roedores. En tercer lugar, el corte de tejidos biológicos y la transferencia de sus secciones a los portaobjetos ITO requerirán una práctica adecuada. Es importante tener en cuenta que mientras se usa el pincel para recoger la sección del escenario, el cepillo debe usarse con delicadeza. Permita que las cerdas del cepillo solo entren en contacto con los bordes de la sección de tejido para disminuir el riesgo de contaminación y fragmentación de la sección. Aplanar la sección en la diapositiva tanto como sea posible, esto evitará el rizo de la sección durante el calentamiento de los dedos. En cuarto lugar, mientras se monta en la diapositiva ITO, asegúrese de que toda la sección esté bien unida a la diapositiva ITO, ya que las diferentes regiones del tejido pueden requerir diferentes tiempos de calentamiento de los dedos. Por ejemplo, el tejido tumoral cerebral requiere un tiempo de calentamiento más largo que el tejido cerebral normal. Un montaje deficiente puede provocar desprendimiento y fragmentación del tejido durante la exploración MALDI-MS. Tenga en cuenta que el calentamiento de los dedos podría permitir la acción enzimática y el metabolismo causando cambios artificiosos de metabolitos. En quinto lugar, una deposición fina y uniforme de la matriz MALDI juega un papel importante en el logro de información espacial precisa y una fuerte señal MALDI-MS. Se recomienda probar la pulverización de la matriz en un portaobjetos en blanco y observar el patrón de cristal bajo un microscopio para verificar la cobertura adecuada, antes de proceder al recubrimiento de la preciosa diapositiva de muestra. Y por último, dado que un investigador individual ejecuta la recolección de tejidos y la preparación de diapositivas a diferentes velocidades, sería ideal tener una persona que maneje la preparación de la muestra para la muestra en la misma cohorte, para minimizar la variación.
El protocolo proporcionado anteriormente detalla los procedimientos estándar, que se pueden adaptar a las necesidades de experimentos particulares. Por ejemplo, un gel crio-seccionador OCT, que normalmente se utiliza en la crio-sección de la muestra, se puede utilizar además como un pegamento de montaje para el mandril de tejido (como en el estudio descrito anteriormente). Estudios previos han demostrado que el componente polimérico en oct causa una fuerte supresión deiones 14. Sin embargo, la incrustación de la muestra puede ser inevitable en los casos en que el tejido es demasiado frágil para ser cortado sin el apoyo adicional de un gel de polímero. Para combatir la supresión de señales en estos casos, los tejidos pueden necesitar ser lavados con lavado en serie en etanol al 70% y etanol al 95% para eliminar la OCT residual para la detección de proteínas o lípidos, mientras que el lavado no se recomienda para la detección de metabolitos moleculares pequeños9.
MALDI MSI se ha vuelto cada vez más relevante tanto en el laboratorio de investigación como en el entorno de la práctica clínica. Por ejemplo, MALDI MSI ha demostrado recientemente ser útil en estudios de proteómica con el fin de caracterizar el estado funcional fenotípico de un organismo15, y en actuar como agente para la identificación microbiana y el diagnóstico de enfermedades posteriores16. Si bien MALDI MSI admite una amplia gama de aplicaciones, existen algunas limitaciones asociadas con confiar únicamente en esta técnica, especialmente cuando se trata de diferenciar entre especies o metabolitos similares, y la identificación de objetivos específicos. Otro desafío es la cuantificación de la concentración de metabolitos de acuerdo con las señales MALDI MSI. A menudo se asume que las abundancias de iones en los espectros MALDI MSI y la distribución espacial (o abundancias relativas) de las especies moleculares correspondientes a través de tejidos disecados están bien correlacionadas. Sin embargo, siempre se debe tener en cuenta que la relación entre la intensidad de los iones y la cantidad de especies moleculares correspondientes se complica por numerosos factores, incluidos, entre otros, los efectos de la supresión de iones, los cambios en la estructura del tejido y las reacciones iónico-molécula17. Las técnicas que hacen uso de estándares internos se pueden implementar para la cuantificación absoluta (tejido μmol/g) en MALDI-MSI18. Estos dos desafíos se abordan típicamente con el flujo de trabajo combinado de MALDI MSI con técnicas de cromatografía líquida en tándem MS (LC-MS / MS), mediante las cuales MALDI-MS permite el mapeo de la región de interés, que luego se somete a microextracción y LC-MS / MS para proporcionar más información para identificar el metabolito19.
Los métodos de imagen basados en la EM se han desarrollado en los últimos años como una modalidad alternativa a las técnicas anteriores para obtener imágenes de metabolitos de moléculas pequeñas. Con los avances y la creciente popularidad de MALDI MSI, se espera que las imágenes MALDI se conviertan en una nueva herramienta estándar para visualizar moléculas pequeñas. Las imágenes de lípidos y moléculas pequeñas endógenas (por ejemplo, neurotransmisores y metabolitos) en el contexto biológico, así como las imágenes de xenobióticos para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos son de particular interés. Se espera que estas tres áreas tengan rápidos avances con la aplicación de MALDI MSI en un futuro próximo20.

Los metabolitos, los productos intermedios o finales del metabolismo, incluidos los nucleótidos, los aminoácidos o ácidos orgánicos, los lípidos, son componentes clave para las funciones y procesos biológicos. La metabolómica, el estudio de los metabolitos, permite la exploración de sus interacciones bioquímicas y la comprensión de sus funciones en el contexto de la investigación básica, traslacional y clínica. Los metabolitos están fuertemente asociados con los fenotipos de los organismos y proporcionan información sobre las actividades bioquímicas que ocurren durante el metabolismo celular1. Por lo tanto, además de la genómica y la proteómica, la metabolómica se ha convertido en una herramienta importante para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas. Por ejemplo, la metabolómica se utiliza para dilucidar los mecanismos detrás de los medicamentos existentes, así como su tolerancia. En el desarrollo de fármacos, el metabolismo xenobiótico es útil para evaluar la actividad o toxicidad de los metabolitos entre especies, lo que luego se traduce en apoyar la medicina personalizada2. A pesar de la amplia aplicación de la metabolómica, la obtención de imágenes de metabolitos puede ser un desafío debido a la reactividad química de los metabolitos, la heterogeneidad estructural y el amplio rango de concentración3. Sin embargo, las concentraciones de metabolitos lábiles, incluidos compuestos de alta energía, glucosa, lactato, glicolítico, vía de derivación de pentosa e intermedios del ciclo TCA, fosfolípidos, neurotransmisores, compuestos de señalización, pueden cambiar en cuestión de segundos y progresar durante minutos cuando las enzimas tisulares están activas durante los procedimientos de recolección de tejidos, como la isquemia postmortem en la recolección cerebral4,5,6 . Para garantizar una adquisición precisa de datos metabolómicos, la preparación adecuada y cuidadosa de la muestra es crítica7,8. Las plataformas establecidas actualmente para medir metabolitos incluyen RMN, ensayos enzimáticos y espectrometría de masas (incluida la cromatografía líquida y de gases), la última de las cuales se analiza más adelante.
MALDI-MSI es una técnica de vanguardia que permite el análisis de muestras complejas a través de la detección de especies moleculares individuales. MALDI MSI otorga el beneficio de poder medir rápida y reproduciblemente varios compuestos moleculares en muestras biológicas. Las imágenes de espectrometría de masas permiten además la producción de imágenes que representan la biología tisular basada en sus metabolitos compuestos, y lo hacen preservando la distribución espacial de los metabolitos en la muestra9. La capacidad de MALDI para detectar analitos en una muestra sin el uso de etiquetas de anticuerpos, modificaciones estructurales u otros reactivos especializados, como los utilizados en inmunotinción, junto con su capacidad para monitorear cientos de moléculas dentro de un solo experimento comprenden solo algunas de las ventajas que otorga la imagen de EM cuando se trata de perfiles metabólicos10, 11. Además de la matriz de uso común como el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y la 9-aminoacridina (9-AA), recientemente se descubrió una nueva matriz N -(1-Naftil) etilendiamina diclorhidrato (NEDC), que es muy adecuada para el análisis de varios metabolitos de bajo peso molecular, ha mejorado aún más la aplicación de MALDI MSI en el perfil metabólico12.
A pesar de la amplia aplicación de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad del procedimiento experimental impiden su implementación más amplia en laboratorios de investigación individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI son apoyados a través de instalaciones básicas compartidas. La preparación de la muestra, incluida la preparación de diapositivas y el recubrimiento de la matriz, es el paso más crítico en MALDI MSI. Sin embargo, la preparación de la diapositiva se lleva a cabo normalmente en el laboratorio del investigador individual, lo que crea variaciones potenciales en la adquisición posterior de MALDI MSI. Aquí nuestro objetivo es proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas antes de proceder a las mediciones de MALDI MSI, y utilizar un perfil metabolómico del cerebro de ratón en desarrollo como ejemplo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

La metabolómica, el estudio para identificar y cuantificar pequeñas moléculas y metabolitos presentes en una muestra experimental, se ha convertido en una herramienta importante para investigar las actividades biológicas durante el desarrollo y las enfermedades. Los enfoques metabolómicos se emplean ampliamente en el estudio del cáncer, la nutrición / dieta, la diabetes y otras afecciones fisiológicas y patológicas que involucran procesos metabólicos. Una herramienta ventajosa que ayuda en el perfil metabolómico defendido en este documento es la imagen de espectrometría de masas de desorción / ionización asistida por láser asistida por matriz (MALDI MSI). Su capacidad para detectar metabolitos in situ sin etiquetado, modificaciones estructurales u otros reactivos especializados, como los utilizados en inmunotinción, hace de MALDI MSI una herramienta única en el avance de metodologías relevantes en el campo de la metabolómica. Un proceso apropiado de preparación de muestras es fundamental para producir resultados óptimos y será el foco de este documento.

El experimento representativo se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 1. Los cerebros de ratón de tipo salvaje C57BL en desarrollo de los días postnatal 1, 21, 60 (adultos) se cosecharon como se describió anteriormente siguiendo las pautas de CUNY IACUC y se congelaron durante 2, 5 y 7 minutos, respectivamente, en un bote de aluminio flotando sobre nitrógeno líquido. Los tejidos congelados se crioseccionaron a secciones de 10 μm de espesor a -15 °C establecidas tanto para la cabeza de la muestra como para la cámara. Las criosecciones de tejido se transfirieron suavemente al lado conductor preenfriado de los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO para imágenes MALDI. Las criosecciones montadas en portaobjetos ITO se desecaron al vacío durante 45 minutos a temperatura ambiente, seguidas de la deposición de la matriz utilizando un pulverizador de matriz automático. Se utilizó la matriz NEDC para detectar metabolitos, y se depositó una solución matricial de 10 mg/mL en metanol/agua (70/30, v/v) a un caudal de 0,1 mL/min y a una temperatura de boquilla de 75 °C durante 12 ciclos con 5 s de secado entre cada ciclo. Se utilizó una velocidad de pulverización de 1300 mm/min, espaciado de vías de 2 mm, presión de gasN 2 de 10 psi y caudal de 3 L/min y altura de boquilla de 40 mm.
Los espectros de masas MALDI fueron adquiridos en modo de iones negativos por el instrumento MALDI time of flight (TOF) MSI. 0.5-1 μL de fósforo rojo (grupos de Pn con n = 1 - 90) emulsión en metanol se depositó en las diapositivas ITO, junto a los tejidos montados, y se utilizó para calibrar el instrumento en el rango de masa de 100 - 1000 m / z mediante la aplicación de la curva de calibración cuadrática13. Los diámetros de los puntos láser se enfocaron al perfil de haz modulado "Medio" para un ancho ráster de 50 μm. Los espectros dentro del rango de masa de m/z 50 a 1000 fueron adquiridos a 1000 Hz para 500 disparos. Se registraron los datos de espectros de masas y las imágenes se analizaron más a fondo utilizando el software avanzado de análisis de datos MALDI MSI. Las imágenes de iones se generaron con normalización de cuadrado medio de raíz (RMS) a un ancho de contenedor de ±0,25 Da.
Los resultados de la Figura 2 muestran imágenes de salida del software de análisis de datos MALDI MSI de espectros m/z seleccionados de cada intervalo de 100 Dalton, representando claramente la utilidad para la identificación de espectros desde metabolitos de moléculas pequeñas hasta lípidos de alto peso molecular. Cada fila representa los respectivos mapas de calor iónico que contienen información espacial y espectral de una determinada especie de metabolitos en tres tejidos recolectados en los días postnatales 1, 21 y 60. Para cada m/z representativo, se puede utilizar el análisis de la distribución regional y las abundancias de iones para comparar cantidades relativas de especies correspondientes entre diferentes edades. Una fortaleza de la metodología MALDI MSI es la capacidad de discernir la especificidad de ciertas especies identificadas por m / z a hitos de desarrollo o estructuras anatómicas específicas. Se observa que algunos metabolitos están enriquecidos en neonatos P1 (m/z 320,1), enriquecidos en adultos P60 (m/z 846,5) o distribuidos uniformemente entre edades (m/z 480,3); otras especies moleculares están específicamente enriquecidas en materia gris (m/z 117.1; 524.3; 765.1), materia blanca (m/z 673.4; 846.5) o CSF/ventrículos (m/z 239.0) (Figura 2A). También se muestra la distribución espacial de metabolitos representativos que incluyen hipoxantina (m/z 135.0), ácido N-acetil-L-aspártico (m/z 174.0), ácido araquidónico (m/z 303.2) y varios lípidos como lisofosfatidiletanolamina LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidiletanolamina PE (44:10) (m/z 838,5), fosfatidilinositol PI(38:4) (m/z 885,6) (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Figura 1. Flujo de trabajo de imágenes de espectrometría de masas maldi-tiempo de vuelo (TOF). El tejido congelado a presión se crirosecciona en criostato y se monta en la diapositiva ITO. → El portaobjetos con secciones de tejido está recubierto con una fina capa de matriz utilizando pulverizador automático de matriz. → espectros de masas es recogido por el instrumento MALDI-TOF MSI a una ráster de 20-200um. → Los datos se analizan y las imágenes se generan utilizando el avanzado software de análisis de datos MALDI MSI. Barra de escala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Figura 2. Salida representativa con espectros m/z seleccionados de espectrometría de masas adquirida a una resolución lateral de 50 μm. (A) Un mapa de calor representa la distribución espacial de especies de metabolitos específicos seleccionados de cada intervalo de 100 Dalton m/z a través de los tres hitos de desarrollo identificados en P1, P21 y P60. (B) La distribución espacial de metabolitos representativos en P1, P21 y P60, incluyendo: hipoxantina, ácido N-acetil-L-aspártico, ácido araquidónico, y diferentes especies de lípidos como lisofosfatidiletanolamina (LPE), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI). Barra de escala, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K vistas.  The City University of New York. El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas. 

Video: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nódulos de las raíces

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...