예 그와 리나트 압잘리모프는 뉴욕 전문 직원 의회 - 시티 대학 (PSC-CUNY) 연구 상 프로그램에 의해 지원됩니다. 유키 첸과 켈리 비라사미는 알프레드 P. 슬론 재단 CUNY 여름 학부 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜은 뉴욕 시 대학 (CUNY) 고급 과학 연구 센터 (ASRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침을 따릅니다.
1. 조직을 수확
<ol><li>알루미늄 보트를 준비합니다. 사각형 알루미늄 10cm x 20cm를 준비하고 중간에 접어 10cm 이중 층 사각형을 만듭니다. 샘플 정보를 한쪽에 표시하고 다른 쪽을 접어 서 바닥 표면이 약 4cm x 4cm인 보트를 형성합니다.</li>
	<li>스티로폼 상자에 액체 질소(LN2)를미리 식힙니다. 참고: 보트가 너무 작으면 샘플이 보트에서 떨어지고 LN2에직접 연락하여 냉동되어 냉동이 될 수 있으며, 이는 냉동 절제 중에 파편화될 수 있습니다.</li>
	<li>기관 IACUC 지침에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 안락사, 즉시 관심의 조직을 해부.<ol>
<li>동물 마취와 스냅 동결 사이의 간격을 가능한 한 짧게 유지, 조직 수확 하는 동안 대사 산물의 변경을 최소화 하기 위해, 특히 사후 허혈으로 인해 뇌의 labial 대사 산물. 참고: 인산염 완충식식염(PBS)을 가진 동물을 관류하면 허혈의 지속 시간이 증가하여 음순 대사 산물의 농도를 더욱 변화시키고 관절 결과를 과장합니다. 따라서, 혈액또는 체액의 오염이 대사산물보다 더 신경이 쓰지 않는 한, PBS로 조직을 세척하거나 세척하는 것은 권장되지 않는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 액체 질소에 떠있는 알루미늄 보트에 조직을 놓고 스티로폼 상자의 뚜껑을 닫고 조직의 크기에 따라 2-10 분 동안 동결하십시오 : 산후 날 1 (P1), P21, P60 마우스 뇌, P60 쥐 뇌는 각각 2 분, 5 분, 7 분, P60 쥐 뇌에 대해 각각 10 분. 참고: 과다 냉동이 극저온 절제 중에 조직 단편화로 이어질 수 있기 때문에 장기간(예: P1 마우스 뇌의 경우 5분)동안 조직을 동결하지 마십시오.</li>
	<li>포셉에 의해 보트를 제거하고, 호일을 접어 조직을 감싸고, 드라이 아이스를 운반하고 나중에 사용하기 위해 -80 °C에 저장하십시오. 즉각적인 단면이 뒤따르는 경우, 드라이 아이스의 샘플을 냉동고스트로 운반하십시오. 참고: 대사 산물을 더 잘 보존하기 위해, MALDI 이미징을 진행하기 직전에 샘플을 그대로 조직에 저장하고 절개하는 것이 바람직하다. 조직은 최대 24개월 동안 -80°C로 저장할 수 있다.</li>
</ol>2. 조직을 극저온
참고: Indium 티산화(ITO) 슬라이드를 처리할 때 항상 장갑을 착용하십시오. 슬라이드에 직접 호흡을 하지 마십시오 또는 티슈 섹션에 인간의 타액의 오염을 방지하기 위해 마스크 (선택 사항)를 착용하지 마십시오.
<ol><li>조직을 단면화하기 전에 원하는 수의 MALDI 호환 ITO 코팅 유리 슬라이드를 수집합니다.</li>
	<li>저항에 설정된 볼트계를 사용하여 슬라이드의 전도도를 테스트합니다. 저항 측정이 읽히는 쪽에 레이블을 지정합니다: 이것은 조직 단면도가 준수하는 측이 될 것입니다. 오염을 피하기 위해 항상 깨끗한 종이 타월에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>-20°C로 설정된 극저온에서 슬라이드를 미리 식힙니다.</li>
	<li>조직 샘플이 -80°C에서 제거된 경우, 조직의 크기에 따라 약 45-60분 동안 극저온 챔버에서 조직을 평형화하게 한다. 샘플이 드라이 아이스에서 제거되면 약 30 분 동안 보정하십시오.</li>
	<li>70% 에탄올로 저온을 철저히 청소하십시오. 저울질 챔버에서 얇은 기울어진 아티스트 브러시와 집게를 포함한 필요한 모든 도구를 미리 식힙니다.</li>
	<li>조직의 종류에 따라 저온 챔버 및 시편 헤드의 온도를 설정 : 간용 -14 °C, 근육용 -20 °C 및 피부9에대한 -25 ° C.</li>
	<li>관심 지역에서 OCT를 피하고, 냉동 조직 포함 화합물 OCT를 사용하여 척에 조직을 마운트.</li>
	<li>깨끗한 블레이드를 무대에 놓고 잠급합니다. 원하는 절단 각도를 달성하기 위해 시편의 단계 및 각도의 위치를 조정합니다. 참고: 조직의 다른 유형/유전자형을 절단해야 하는 경우, 블레이드의 깨끗한 부분이 사용되도록 시료를 재배치하거나 교차 오염을 방지하기 위해 다음 샘플을 절단하기 전에 새 블레이드로 변경해야 합니다.</li>
	<li>관심 영역(예: 뇌의 코퍼스 캘로섬)이 발견될 때까지 계속 절단하십시오. 극저온에 평형화 된 아티스트 브러시로 여분의 조각을 닦아 무대를 깨끗하게 유지하십시오.</li>
	<li>원하는 영역이 밝혀지면 두께10-12 μm의 작은 부분을 잘라냅니다. 단면도가 쉽게 조각하거나 떨어지는 경향이 있는 경우, -22°C에서 -11°C 범위로 유지하여 저온의 온도를 높입니다. 우리는 뇌 조직에 대한 최적의 절삭 온도가 -15 °C - 18 °C임을 발견했다.</li>
	<li>좋은 섹션이 절단되면 ITO 슬라이드에 부착하십시오 (극저온 챔버에서 작동).</li>
	<li>티슈의 한 부분을 아티스트 브러시 의 끝을 사용하여 ITO 슬라이드에 전달합니다.</li>
	<li>슬라이드 아래에 손가락을 대고 섹션을 따뜻하게 하여 섹션을 따뜻하게하여 안전한 장착을 보장합니다. 조직 섹션은 먼저 5-10 s에서 투명하게 전환한 다음 약 30-60 s에서 불투명하게 변합니다.</li>
	<li>조심스럽게 미끄럼에 슬라이드를 따로 설정합니다.</li>
	<li>조직의 각 섹션이 슬라이드에 균등하게 배치되고 가능한 한 정렬되도록 다른 조직 샘플을 위한 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>MALDI 대상은 최대 2개의 슬라이드를 보유할 수 있기 때문에 동일한 코호트의 여러 샘플의 섹션을 단일 슬라이드 또는 두 슬라이드에 배치하여 동시에 분석할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>완료되면 ITO 슬라이드를 진공 상자에 놓고 건조제를 사용하여 건조기로 옮습니다. 45-60 분 동안 슬라이드를 진공 건조시하십시오. 참고: 실험실에서 진공 건조기를 사용할 수 없는 경우 슬라이드를 항상 -20°C 이하로 유지하여 대사 산물 열화를 피하십시오.</li>
	<li>슬라이드 저장 및 배송: MALDI 이미징 코어 시설에서 샘플을 준비하지 않는 한 MALDI 이미징으로 직접 진행하거나- 80°C에 슬라이드를 저장하거나 건조 얼음에 대한 핵심 시설 또는 기타 MALDI 연구 실험실에 배송한다.</li>
	<li>샘플을 가장 잘 보존하려면 슬라이드를 슬라이드 수송에 넣고 질소 (선택 사항)로 채우고, 파라필름으로 밀봉하고 지퍼 백에 넣은 다음 건조제가 들어있는 다른 지퍼 백에 넣습니다. 외부 지퍼 백에 라벨을 부착하십시오.</li>
	<li>-80°C(최대 6개월)에 보관하거나 적절한 드라이 아이스로 배송합니다.</li>
</ol>3. 매트릭스 준비
<ol><li>행렬을 준비합니다. 참고: 모든 시약은 HPLC 등급이어야 합니다.<ol>
<li>10 mg /mL의 농도에서 NEDC를 준비하십시오. 70% 메탄올의 용매에 용해된 10mL의 매트릭스(NEDC 100 mg, 메탄올 7mL,H2O3mL)를 준비한다.</li>
		<li>또한 매트릭스를 채우기 전에 분무기 시스템을 플러시하기 위해 70 % 메탄올 : 물 용액의 추가 10 mL을 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드가 2.17 단계에서 탈수되면 굵은 점 실버 마커를 사용하여 조직 섹션 외부유리 슬라이드의 빈 공간에 "X"마크를 배치한 다음 실버 "X"위에 미세한 점 의 검은 색 마커가있는 두 번째 "x"를 놓습니다. 실버 배경(굵은 은 "X")에서 선명한 콘트라스트를 한 블랙 "X"는 나중에 MALDI 계측기의 후기 질량 스펙트럼 획득을 위한 신탁 마커역할을 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 MALDI 슬라이드 금속 대상에 로드합니다. 플라스틱 커버를 사용하고 샘플이 플라스틱 덮개에 있는 윤곽선을 그립니다. 곁.</li>
	<li>플랫 베드 스캐너를 사용하여 MALDI 대상과 함께 슬라이드 이미지를 스캔합니다. 대상 표면의 나사는 스캐너에 의한 조직 섹션의 손상 또는 오염을 방지하기 위해 스페이서 역할을 합니다. 선택한 슬라이드 영역을 16비트 그레이스케일 및 2400 dpi로 미리 보고 스캔합니다. MALDI MSI에서 나중에 사용할 이미지를 저장합니다.</li>
</ol>4. 매트릭스 증착
참고: 승화, 액적 잉크젯 인쇄, 자동 매트릭스 분무기 및 아티스트 에어부시9를사용하여 수동 스프레이를 포함하여 MALDI 슬라이드에 미세 한 결정 크기의 매트릭스의 짝수 층을 적용하는 여러 가지 방법이 있습니다. 우리는 높은 재현성을 위해이 프로토콜의 예로 자동 매트릭스 분무기를 사용합니다.
<ol><li>시작: 매트릭스 분무기 장치를 켜고 밸브가 LOAD에 배치되어 있는지 확인하고 분무기 소프트웨어를 시작합니다. 배기 팬이 잘 작동하고 있는지 확인합니다. 액티브 통풍구가 제대로 작동하지 않는 경우 용매 펌프를 시작하지 마십시오.</li>
	<li>모든 것이 통신하고 있음을 Comms 탭에서 확인한 다음 ~500 psi (또는 3.4 MPa)의 역압으로 .1 mL / min에서 용매 펌프를 시작합니다.</li>
	<li>질소 탱크를 30 psi로 설정하여 매트릭스 분무기로 압축 공기 흐름을 시작합니다. 그런 다음 분무기 전면의 압력 조절기를 10 psi로 조정하고 원하는 대로 분무기 노즐 온도를 설정합니다. 참고: 기도의 기압이 5psi 미만인 경우 분무기 노즐은 보호를 위해 가열할 수 없습니다.</li>
	<li>밸브가 LOAD 위치에 있는 경우 주사기를 사용하여 7mL의 7mL메탄ol으로 루프를 플러시한 다음 6mL의 매트릭스로 루프를 채웁니다.</li>
	<li>조직 슬라이드를 분무기의 홀더에 배치하고, 양 끝을 테이핑하여 움직임을 방지하고, 매트릭스에 의해 MALDI 대상에 금속 클램프의 오염을 피하기 위해 매트릭스없는 가장자리를 보존한다. 참고: 귀중한 샘플 슬라이드로 진행하기 전에 빈 현미경 슬라이드에서 먼저 매트릭스 스프레이를 테스트하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>유량과 온도가 안정적으로 살포를 시작하도록 확인하십시오.</li>
	<li>빈 유리 슬라이드를 사용하여 미리 테스트된 원하는 방법을 선택합니다.</li>
	<li>시작을 누릅니다. 이렇게 하면 노즐 온도를 설정하고 펌프 유량을 조정하여 선택한 방법에 맞게 조정합니다. 밸브를 로드에서 스프레이 위치로 전환한 다음 계속을클릭하여 확인합니다.</li>
	<li>메서드에 따라 슬라이드당 5-20분정도 걸리는 시스템을 실행할 수 있습니다. 밸브를 스프레이에서 로드 위치로 전환한 다음 완료되면 계속을 클릭하여 확인합니다.</li>
	<li>분무기에서 슬라이드(들)를 제거하고 현미경하에서 매트릭스 코팅 패턴을 검사하여 미세 매트릭스 결정의 균일 한 층을 보장합니다.</li>
	<li>매트릭스 증착 후 슬라이드(들)를 금속 MALDI 홀더에 넣고 즉시 사용하십시오. 표본 슬라이드가 하나만 있는 경우 다른 빈 슬라이드를 추가하여 MALDI 홀더의 두 공백을 채웁니다.</li>
	<li>분무기 노즐의 막힘을 방지하기 위해 제조업체의 지시에 따라 사용 후 즉시 시스템을 정리합니다.</li>
	<li>샘플 슬라이드가 매트릭스로 코팅된 후 MALDI 이미징 기기로 즉시 진행하거나 2.19 단계에서 설명된 동일한 이중 지퍼 백 준비를 사용하여 드라이 아이스로 발송합니다. 참고: MALDI 기기와 같은 비상 상황에서는 즉시 사용할 수 없으며, 코팅된 슬라이드를 진공 상태 또는 -20°C에 최대 24시간 동안 저장하지만 일부 대사산물의 열화는 저장 중에 발생할 수 있으며, 이는 철저히 연구되지 않았다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI)는 연구원이 다양한 생체 분자의 분포와 병리학의 분자 기초인 조직에 있는 그들의 수정을 조사할 수 있는 레이블없는 화상 진찰 기술입니다. MALDI-MSI와 조직 분석을 위한 기존의 LC-MS 접근법을 결합하여 기존의 Omics 워크플로우와 동일한 분자 깊이를 제공하지만 셀룰러 네트워크 내에서 이러한 신호의 공간 적 관계를 유지합니다. 샘플 제제는 MALDI MSI에서 가장 중요한 단계이며 다른 실험실4에서수행된 메타볼로믹스 연구의 최종 판독 아웃의 변화를 설명합니다. 여기에서 우리는 MALDI MSI를 사용하여 metabolomic 프로파일링을 위한 견본 준비를 표준화하기 위하여 포괄적이면서도 실용적인 프로토콜을 제공합니다, 그것은 기초 생물학에서 번역 연구에 그들의 현재와 미래 연구에서 MALDI MSI를 구현하는 광범위한 연구 지역 사회에 유익할 것이라는 희망.
하나는 항상 샘플 준비 동안 분자 프로파일 (풍부하고 공간 분포 모두)의 변화를 최소화하고 오염을 피하기 위해 모든 예방 조치를 염두에 두어야합니다. 첫째, 동물 안락사와 조직 수확 사이의 시간을 최소화, 이러한 장소에서 냉동 또는 후혈에 대한 책임을 줄이기 위해 뇌의 효소를 비활성화하기 위해 마이크로파 고정에 의해 가열등 4,5,6. 둘째, 샘플의 스냅 동결 상태는 매우 중요합니다. 부적당한 동결은 대사 산물의 분해 및 손실을 일으키는 원인이 될 것입니다, 동결을 통해 동결하는 동안 극저온 절제 도중 조직 단편화로 이끌어 낼 것입니다. 동결 시간은 항상 이전보고 된 연구에 따라 먼저 테스트해야하며,이 논문에 제시 된 발달 마우스 뇌의 연구는 설치류 뇌 조직에 대한 기준점을 제공합니다. 셋째, 생물학적 조직을 절단하고 섹션을 ITO 슬라이드로 옮기려면 적절한 연습이 필요합니다. 브러시를 사용하여 스테이지에서 섹션을 픽업하는 동안 브러시를 섬세하게 사용해야 합니다. 브러시의 강모는 오염 및 단면 단편화의 위험을 줄이기 위해 조직 섹션의 가장자리와 만 접촉할 수 있도록 합니다. 슬라이드의 섹션을 가능한 한 평평하게 하여 손가락 을 따뜻하게하는 동안 섹션의 컬링을 방지할 수 있습니다. 넷째, ITO 슬라이드에 장착하는 동안 조직의 다른 영역이 손가락 온난화의 다른 시간을 필요로 할 수 있기 때문에 전체 섹션이 ITO 슬라이드에 잘 부착되어 있는지 확인하십시오. 예를 들면, 뇌종양 조직은 일반적인 두뇌 조직 보다는 더 긴 온난화 시간을 요구합니다. 가난한 장착MALDI-MS 스캐닝 하는 동안 조직의 분리 및 단편화로 이어질 수 있습니다. 손가락 온난화는 대사 산물의 관절 변화를 일으키는 효소 작용과 신진 대사를 가능하게 할 수 있음을 명심하십시오. 다섯째, MALDI 매트릭스의 미세하고 균일한 증착은 정확한 공간 정보와 강력한 MALDI-MS 신호를 달성하는 데 중요한 역할을 합니다. 빈 슬라이드에 분사매트를 테스트하고, 귀중한 시편 슬라이드의 코팅을 진행하기 전에 적절한 커버리지를 확인하기 위해 현미경으로 결정 패턴을 관찰하는 것이 좋습니다. 그리고 마지막으로, 개별 연구원이 다른 속도로 조직 수확 및 슬라이드 준비를 실행하기 때문에, 동일한 코호트에서 시편에 대한 시료 준비를 처리하고, 변화를 최소화하기 위해 한 사람이 하는 것이 이상적입니다.
위에 제공된 프로토콜은 특정 실험의 요구에 맞게 조정할 수 있는 표준 절차를 자세히 설명합니다. 예를 들어, 일반적으로 샘플의 저온 절개에 사용되는 극저온 단면 젤 OCT는 조직 척에 장착 접착제로 더 활용될 수 있다(위에서 설명한 연구에서와 같이). 이전 연구는 OCT의 폴리머 성분이 강한 이온억제(14)를유발하는 것으로 나타났다. 그러나, 시료를 포함시키는 것은 조직이 너무 약해서 폴리머 겔로부터의 추가지지 없이 절단될 수 없을 때 피할 수 있다. 이러한 경우에 신호 억제에 대처하기 위해, 조직은 단백질 또는 지질의 검출을 위해 잔류 OCT를 제거하기 위해 70 % 에탄올과 95 %의 에탄올에서 직렬 세척으로 세척될 필요가 있을 수 있으며, 세탁은 작은 분자 대사 산물9의검출을 위해 권장되지 않는다.
MALDI MSI는 실험실과 임상 실습 환경에서 점점 더 관련성이 높아졌습니다. 예를 들어, MALDI MSI는 최근유기체(15)의현상 기능 상태를 특성화하고, 후속질환(16)의미생물 식별 및 진단을 위한 제제로서 작용하는 프로테오믹스의 연구에서 유용하다. MALDI MSI는 광범위한 응용 프로그램을 지원하지만, 특히 유사한 종이나 대사 산물 간의 분화 및 특정 표적 식별에 관해서는 이 기술에만 의존하는 것과 관련된 몇 가지 제한이 있습니다. 또 다른 과제는 MALDI MSI 신호에 따른 대사 산물 농도의 정량화입니다. MALDI MSI 스펙트럼과 해부된 조직에 걸쳐 해당 분자 종의 공간 분포 (또는 상대적 풍부)의 이온 풍부가 잘 상관관계가 있다고 가정합니다. 그러나, 이온 강도와 해당 분자 종의 양 사이의 관계는 이온 억제의 효과, 조직 구조의 변화 및 이온 분자반응(17)을포함하되 이에 국한되지 않는 수많은 요인에 의해 복잡하다는 것을 항상 명심해야 한다. MALDI-MSI18에서절대 정량화(μmol/g 조직)를 위해 내부 표준을 사용하는 기술을 구현할 수 있다. 이러한 두 가지 과제는 일반적으로 MALDI MSI의 액체 크로마토그래피 탠덤 MS(LC-MS/MS) 기법을 결합하여 해결되며, MALDI-MS는 나중에 마이크로추출 및 LC-MS/MS를 통해메타볼라이트(19)를식별하기 위한 더 많은 정보를 제공할 수 있도록 관심 영역의 매핑을 허용한다.
MS 기반 이미징 방법은 최근 몇 년 동안 소분자 대사 산물을 이미징하기 위한 이전 기술에 대한 대체 양상으로 개발되었습니다. MALDI MSI의 발전과 인기가 증가함에 따라 MALDI 이미징은 작은 분자를 시각화하는 새로운 표준 도구가 될 것으로 예상됩니다. 생물학적 맥락에서 지질 및 내인성 소분자(예: 신경 전달물질 및 대사산물)의 이미징뿐만 아니라 새로운 제약 에이전트 개발을 위한 제노바이오틱스의 이미징이 특히 흥미롭습니다. 이 세 가지 영역은 가까운 장래에 MALDI MSI의 적용과 함께 급속한 발전을 할 것으로 예상된다20.

대사 산물, 뉴클레오티드, 아미노산 또는 유기산, 지질을 포함한 신진 대사의 중간 또는 최종 제품은 생물학적 기능 및 프로세스의 핵심 구성 요소입니다. 대사 산물의 연구 인 Metabolomics는 생화학적 상호 작용의 탐구와 기본, 번역 및 임상 연구의 맥락에서 자신의 역할에 대한 이해를 허용합니다. 대사 산물은 유기체의 표현형과 강하게 연관되고 세포 대사1중에 발생하는 생화학적 활동에 대한 정보를 제공한다. 따라서 유전체학 및 프로테오믹스 외에도 메타볼로믹스는 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 도구로 부상했습니다. 예를 들어, 메타볼로믹스는 기존 약물의 메커니즘과 관용을 해명하는 데 사용됩니다. 약물 개발에서, xenobiotic 물질 대사는 나중에 개인화 된 약을 지원하는 것으로 변환 종에 걸쳐 대사 산물의 활성 또는 독성을 평가하는 데 유용합니다2. 메타볼로믹스의 광범위한 적용에도 불구하고 대사산물의 이미징은 대사산물의 화학 반응성, 구조적 이질성 및 광범위한 농도 범위3으로인해 어려울 수 있다. 그러나, 고에너지 화합물, 포도당, 젖산, 글리코리틱, 펜토스 션트 경로 및 TCA 주기 중간체, 인지질, 신경전달물질, 신호화합물 등 음비대사산물의 농도는 조직 수확 절차 중에 조직 효소가 활성화될 때 몇 초 안에 변화하고 진행될 수 있으며, 포스트모템은 뇌 수확시술(4) 뇌수확에 6, 뇌 수확술 등 뇌수확시 6, 뇌 수확술 등4,뇌수확에 신경이 쓰이는 등 뇌의 약자 수수(4) . 정확한 메타볼로믹스 데이터 수집을 보장하기 위해 적절하고 신중한 샘플 준비는7,8매우중요합니다. 대사 산물을 측정하기위한 현재 확립 된 플랫폼은 NMR, 효소 분석 및 질량 분석법 (액체 및 가스 크로마토그래피 포함)을 포함하며, 그 중 마지막은 아래에서 더 논의됩니다.
MALDI-MSI는 개별 분자 종의 검출을 통해 복잡한 견본의 분석을 허용하는 최첨단 기술입니다. MALDI MSI는 생물학적 샘플에서 다양한 분자 화합물을 신속하고 재현적으로 측정할 수 있다는 이점을 부여합니다. 질량 분석 이미징은 복합 대사 산물에 기초하여 조직 생물학을 나타내는 이미지의 생산을 더욱 허용하고, 샘플9에서대사 산물의 공간 분포를 보존하면서 그렇게한다. MALDI의 항체 라벨링, 구조적 변형 또는 면역스테인링에 사용되는 것과 같은 기타 특수 시약을 사용하지 않고 샘플에서 분석체를 검출하는 MALDI의 능력은 단일 실험 내에서 수백 개의 분자를 모니터링하는 능력과 결합되어 대사프로파일링(10)에관해서 MS 이미징이 부여하는 몇 가지 장점만을포함합니다. 11. 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 9-아미노아크리딘(9-AA)과 같은 일반적으로 사용되는 매트릭스 외에도 최근에 발견된 새로운 매트릭스 N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로리드(NEDC)는 다양한 저분자 중량 대사산물의 분석에 적합하며, MALDI12의MALDI 적용을 더욱 개선하였다.
MALDI MSI의 광범위한 적용에도 불구하고, 계측기의 높은 비용과 실험 절차의 복잡성은 개별 연구 실험실에서 의 광범위한 구현을 방지합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 통해 지원됩니다. 슬라이드 제제 및 매트릭스 코팅을 포함한 샘플 제제는 MALDI MSI에서 가장 중요한 단계입니다. 그러나, 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구원의 실험실에서 수행됩니다, 이는 나중에 MALDI MSI 취득에 있는 잠재적인 변이를 만듭니다. 여기서 는 MALDI MSI 측정을 진행하기 전에 생물학적 샘플의 샘플 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 발달 마우스 뇌의 메타볼로믹 프로파일링을 예로 사용하는 것을 목표로 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

실험 샘플에 존재하는 소분자와 대사산물을 식별하고 정량화하는 연구인 메타볼로믹스는 개발 및 질병 중 생물학적 활동을 조사하는 중요한 도구로 부상했습니다. Metabolomics 접근은 널리 암의 연구 결과에서 사용, 영양/다이어트, 당뇨병, 그리고 신진 대사 과정을 포함 하는 다른 생리적, 병 적 조건. 이 논문에서 옹호하는 메타볼로믹 프로파일링에 도움이 되는 유리한 도구는 매트릭스 보조 레이저 탈색/이온화 질량 분광화상 이미징(MALDI MSI)입니다. 면역학 분야에서 관련된 방법론을 발전시키는 독특한 도구인 MALDI MSI는 라벨링, 구조 적 변형 또는 기타 특수 시약 없이 현장에서 대사산물을 검출하는 능력이 독특합니다. 적절한 샘플 준비 프로세스는 최적의 결과를 산출하는 데 중요하며 이 백서의 초점이 될 것입니다.

대표적인 실험은 도 1에표시된 워크플로에 따라 수행하였다. 산후 1일, 21일, 60(성인)의 발달 C57BL 야생형 마우스 뇌는 CUNY IACUC 지침에 따라 상술한 바와 같이 수확되었으며 액체 질소에 떠있는 알루미늄 보트에 각각 2, 5 및 7 분 동안 얼어 붙었다. 동결된 조직은 표본 헤드와 챔버 모두에 대해 -15°C 의 10 μm 두께 섹션에서 냉동을 하였다. 조직 저온 섹션은 MALDI 이미징을 위해 ITO 코팅 유리 슬라이드의 미리 냉각된 전도성 측면으로 부드럽게 전달되었습니다. ITO 슬라이드에 장착된 냉동절은 실온에서 45분 동안 진공 상태에서 건조되었고, 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스 증착이 뒤따랐다. 매트릭스 NEDC는 대사 산물을 검출하는 데 사용되었으며, 메탄올/물(70/30, v/v)에서 10 mg/mL의 매트릭스 용액은 0.1mL/min의 유속및 75°C의 노즐 온도로 각 사이클 사이에 5s 건조를 가하는 데 사용하였다. 분무 속도 1,300mm/min, 트랙 간격 2mm, 10 psi의 N2 가스 압력 및 3 L/min의 유속 및 40mm의 노즐 높이가 사용되었습니다.
MALDI 질량 스펙트럼은 비행의 MALDI 시간 (TOF) MSI 악기에 의해 음의 이온 모드에서 획득되었다. 0.5-1 μL의 적색 인(n = 1 -90)의 에멀젼은 장착된 조직 옆에 있는 ITO 슬라이드에 증착되었고, 100-1000 m/z 질량 범위에서 계측기를 교정하는 데사용하였다. 레이저 스팟 직경은 50 μm 래스터 폭의 "중간" 변조 빔 프로파일에 초점을 맞췄습니다. m/z 50에서 1000까지의 질량 범위 내의 스펙트럼은 500발의 1000Hz에서 획득되었다. 질량 스펙트럼 데이터가 기록되었고, 이미징은 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석되었다. 이온 이미지는 루트 평균 정사각형(RMS) 정규화로 ±0.25 Da의 빈 폭으로 생성되었습니다.
그림 2의 결과는 100개의 달튼 간격에서 선택된 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어의 출력 영상을 보여 주며, 소분자 대사산물에서 고분자 량 지질에 이르는 스펙트럼을 식별하는 유틸리티를 명확하게 묘사합니다. 각 행은 산후 1, 21 및 60에서 수집된 3개의 조직에 걸쳐 특정 대사산물 종의 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함하는 각각의 이온 열지도를 묘사합니다. 각 대표 m/z에 대해, 지역 분포와 이온 풍부의 분석은 서로 다른 연령 사이의 해당 종의 상대적 양을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. MALDI MSI 방법론의 강도는 m/z에 의해 확인된 특정 종의 특이성을 발달 이정표 또는 특정 해부학 적 구조로 분별하는 능력입니다. 일부 대사 산물P1 신생아 (m/z 320.1), P60 성인 (m/z 846.5)에 농축 되 거나 연령에 걸쳐 균일 하 게 분포 하는 것으로 관찰 됩니다 (m/z 480.3); 다른 분자 종은 특히 회색 물질 (m/z 117.1; 524.3; 765.1), 백색 물질 (m/z 673.4; 846.5), 또는 CSF / 심실 (m/z 239.0)(그림 2A)에서농축된다. 저산소산틴(m/z 135.0), N-아세틸-L-아스파르트산(m/z 174.0), 아라치도니아산(m/z 303.2), 리소포스파일레탄탄민 LPE(18:18)와 같은 여러 지질을 포함한 대표적인 대사산물의 공간 분포(m/z 135.0), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE(22:6), (m/z 524.3), 포스파디에틸레탄올라민 PE(44:10) (m/z 838.5), 포스파디딜리노시톨 PI(38:4) (m/z 885.6)도2B(m/z885.6)를 나타내었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> 그림 1. MALDI- 비행 시간 (TOF) 질량 분광화상의 워크플로우. 스냅 냉동 조직은 냉동 저온에 극저고 ITO 슬라이드에 장착됩니다. → 조직 섹션슬라이드는 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스의 미세층으로 코팅된다. → 질량 스펙트럼은 20-200um의 래스터에서 MALDI-TOF MSI 기기에 의해 수집됩니다. → 데이터를 분석하고 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지가 생성됩니다. 스케일 바: 2mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> 그림 2. 50 μm 측면 해상도에서 획득 된 질량 분석법에서 선택된 m / z 스펙트럼을 가진 대표 출력. (A)열지도는 P1, P21 및 P60에서 확인된 세 가지 발달 이정표에 걸쳐 100 달튼 m/z 간격마다 선택된 특정 대사산물 종의 공간 분포를 묘사한다. (B)P1, P21 및 P60에서 대표적인 대사산물의 공간 분포는 저산소산틴, N-아세틸-L-아스파르트산, 아라치도닉산, 리소포스파디들레타놀라민(LPE), 포스파디들레탄올라민(PE), 포스파디에틸다민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라인탄아민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탈탄아민(PE), 포스파디딜라탈탄올라민(PE), 포스파디딜라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탈라민(PE), 포세파다틸다탈라민(PE), 포세파틸다탈라민(PE), 포자측피톨라민(PE), 포세틸다딜라네민(PE), 포세이다딜라민(PE), 포 스케일 바, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K 조회수.  The City University of New York. 이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다. 

비디오: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Methods Article

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비