Ye He e Rinat Abzalimov são apoiados pelo Programa de Prêmios de Pesquisa do Congresso da Cidade do Profissional da Universidade de Nova York (PSC-CUNY). Yuki Chen e Kelly Veerasammy são apoiados pelo Programa de Pesquisa de Graduação de Verão da Fundação Alfred P. Sloan CUNY.

O protocolo segue as diretrizes do Centro de Pesquisa em Ciência Avançada (IACUC) da City University of New York (CUNY) Advanced Science Center (ASRC) institucional.
1. Colher o tecido
<ol><li>Prepare o barco de alumínio. Prepare um retângulo de alumínio 10cm x 20 cm, dobre no meio para fazer 10 cm quadrado de camada dupla. Rotule as informações da amostra de um lado e dobre o outro lado para formar um barco com superfície inferior de cerca de 4 cm x 4 cm.</li>
	<li>Pré-covil do barco sobre o nitrogênio líquido (LN2) em uma caixa de isopor. NOTA: Se o barco for muito pequeno, a amostra pode cair do barco e ficar congelada entrando em contato direto com a LN2, o que pode resultar em fragmentação durante a crioseção.</li>
	<li>Eutanize o animal por deslocamento cervical seguindo as diretrizes institucionais da IACUC, disseca imediatamente o tecido de interesse.<ol>
<li>Mantenha o intervalo entre anestesia animal e congelamento de estalos o mais curto possível, para minimizar a alteração de metabólitos durante a colheita de tecidos, especialmente os metabólitos labiais no cérebro devido à isquemia pós-morte. NOTA: A perfusão do animal com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) aumentará a duração da isquemia, alterando ainda mais as concentrações de metabólitos labile e exagerando os resultados artefatos. Portanto, a perfusão ou lavagem do tecido com PBS não é recomendada, a menos que a contaminação do sangue ou fluido corporal esteja mais preocupada do que a deterioração ou lavagem de metabólitos para projeto individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque imediatamente o tecido no barco de alumínio flutuando sobre nitrogênio líquido, feche a tampa da caixa de isopor e congele por 2-10 min dependendo do tamanho do tecido: 2 min, 5 min, 7 min para o dia pós-natal 1 (P1), P21, cérebro de rato P60, respectivamente, e 10 min para cérebro de rato P60. NOTA: Não congele o tecido por tempo prolongado (por exemplo, 5 min para cérebro de rato P1) pois o excesso de congelado pode levar à fragmentação do tecido durante a criosecção.</li>
	<li>Remova o barco por fórceps, dobre a folha para enrolar o tecido, transporte em gelo seco e armazene a -80 °C para uso posterior. Se seguido por secção imediata, leve as amostras em gelo seco para o criostat. NOTA: Para preservar melhor os metabólitos, é preferível armazenar a amostra em tecido intacto e secioná-la logo antes de proceder à imagem MALDI. O tecido pode ser armazenado em -80 °C por até 24 meses.</li>
</ol>2. Criosection o tecido
NOTA: Use luvas o tempo todo ao manusear os slides de tinóxido de índio (ITO). Evite respirar diretamente na lâmina ou usar máscaras (opcional) para evitar a contaminação da saliva humana na seção tecidual.
<ol><li>Antes de seccionar o tecido, reúna o número desejado de lâminas de vidro revestidas de ITO compatíveis com MALDI.</li>
	<li>Teste a condutividade do slide usando um conjunto de voltímetros para resistência. Rotule o lado onde uma medição de resistência é lida: este será o lado a que as seções teciduais aderem. Coloque sempre o slide em uma toalha de papel limpa para evitar contaminação.</li>
	<li>Pré-esfrie os slides em um criostat definido para -20 °C.</li>
	<li>Se as amostras de tecido foram removidas do -80 °C, deixe o tecido equilibrar na câmara criostat por cerca de 45-60 min, dependendo do tamanho do tecido. Se as amostras estiverem se removendo do gelo seco, equilibre-a por cerca de 30 minutos.</li>
	<li>Limpe completamente o criostat com 70% de etanol. Pré-esfrie todas as ferramentas necessárias, incluindo pincel de artista de ponta fina e fórceps na câmara criostat.</li>
	<li>Ajuste a temperatura da câmara criostat e da cabeça da amostra de acordo com o tipo do tecido: -14 °C para fígado, -20 °C para músculo e -25 °C para pele9.</li>
	<li>Monte o tecido para o mandril usando tecido criográfico incorporando composto OCT, evitando OCT da região de interesse.</li>
	<li>Coloque uma lâmina limpa no palco e bloqueie. Ajuste a posição do estágio e o ângulo da amostra para alcançar o ângulo de corte desejado. NOTA: Se diferentes tipos/genótipos de tecido forem cortados, certifique-se de reposicionar a amostra para que uma parte limpa da lâmina seja usada ou mudar para uma nova lâmina antes de cortar a próxima amostra para evitar contaminação cruzada.</li>
	<li>Continue cortando até que a região de interesse (por exemplo, corpus calosum no cérebro) seja encontrada. Certifique-se de manter o palco limpo, escovando peças extras com um pincel de artista que foi equilibrado no criostat.</li>
	<li>Uma vez que a região desejada é revelada, corte seções menores de 10-12 μm de espessura. Se a seção tende a se desfazer ou desmoronar facilmente, aumente a temperatura do criostat, permanecendo na faixa de -22 °C a -11 °C. Descobrimos que a temperatura de corte ideal para o tecido cerebral é de -15 °C a - 18 °C.</li>
	<li>Uma vez que uma boa seção tenha sido cortada, adere ao slide ITO (opere na câmara criostat).</li>
	<li>Transfira uma seção do tecido para lâminas ITO usando a ponta da escova de artista.</li>
	<li>Aqueça a seção colocando um dedo sob o slide para aquecer a seção para garantir a montagem segura. A seção tecidual primeiro se transformará em transparente em 5-10 s e, em seguida, ficará opaca em cerca de 30-60 s.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente o slide de lado no criostat.</li>
	<li>Repita passos para outras amostras de tecido, garantindo que cada seção do tecido seja colocada uniformemente na lâmina e esteja o mais alinhada possível.</li>
	<li>Uma vez que o alvo MALDI pode conter até dois slides, coloque as seções de várias amostras da mesma coorte em um único slide ou em dois slides, para garantir que eles possam ser analisados ao mesmo tempo.</li>
	<li>Quando terminar, coloque os slides da ITO em uma caixa de vácuo e transfira para um dessecante com dessecante. Seque o slide por 45-60 min. NOTA: Se um desiccador de vácuo não estiver disponível no laboratório, mantenha os slides abaixo de -20 °C o tempo todo para evitar a deterioração dos metabólitos.</li>
	<li>Armazenamento e envio de slides: a menos que a amostra seja preparada pelas instalações do núcleo de imagem MALDI para proceder diretamente à imagem MALDI, armazene os slides a -80 °C ou envie para instalações centrais ou outros laboratórios de pesquisa MALDI em gelo seco.</li>
	<li>Para melhor preservar as amostras, coloque os slides no transportador de slides, encha-os com nitrogênio (opcional), lacre com parafilm, coloque em um saco zip, que é então colocado em outro saco zip contendo dessecante. Rotule o saco zip externo.</li>
	<li>Prossiga para armazenamento a -80 °C (até 6 meses) ou transporte com gelo seco adequado.</li>
</ol>3. Preparação matricial
<ol><li>Prepare a matriz. NOTA: Todos os reagentes devem ser de grau HPLC.<ol>
<li>Prepare NEDC em uma concentração de 10 mg/mL. Prepare 10 mL de matriz dissolvida em um solvente de 70% de metanol (100 mg de NEDC, 7 mL de metanol, 3 mL de H2O).</li>
		<li>Além disso, prepare um adicional de 10 mL de 70% de solução de metanol:água para lavar o sistema de pulverizador antes de preencher a matriz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que os slides estejam desidratados na etapa 2.17, coloque marcas "X" no espaço em branco do deslizamento de vidro fora das seções de tecido usando um marcador de prata de ponto ousado, e, em seguida, coloque um segundo "x" com um marcador preto de ponto fino em cima do "X" prata. O "X" preto com um contraste acentuado do fundo prateado (o prata ousado "X") mais tarde servirá como marcador fiduciário para a posterior aquisição de espectros em massa no instrumento MALDI.</li>
	<li>Carregue o slide no alvo de metal de slides MALDI. Use tampa plástica e desenhe/delineie onde as amostras estão na tampa de plástico. Reservar.</li>
	<li>Escaneie a imagem do slide juntamente com o alvo MALDI usando o scanner de cama plana. Os parafusos na superfície do alvo servirão como espaçador para evitar danos ou contaminação da seção tecidual pelo scanner. Visualize e escaneie a área de slides selecionada em escala de cinza de 16 bits e 2400 dpi. Salve a imagem para uso posterior no MSI MALDI.</li>
</ol>4. Depoimento matricial
NOTA: Existem vários métodos para aplicar uma camada uniforme de matriz em tamanho de cristal fino no slide MALDI, incluindo sublimação, impressão de jato de tinta de gotícula, pulverizador de matriz automática e spray manual usando o artista airbush9. Usaremos o pulverizador de matriz automático como exemplo neste protocolo para sua alta reprodutibilidade.
<ol><li>Inicie: Ligue a unidade do pulverizador de matriz, tendo certeza de que a válvula está posicionada no LOAD e inicie o software do pulverizador. Verifique se o ventilador de escape está funcionando bem. Não inicie a bomba de solvente se a ventilação ativa não estiver funcionando corretamente.</li>
	<li>Confirme na guia Comms que tudo está se comunicando e, em seguida, inicie a bomba de solvente a .1 mL/min, com uma pressão traseira de ~500 psi (ou 3,4 MPa).</li>
	<li>Inicie o fluxo de ar comprimido para o pulverizador de matriz, colocando o tanque de nitrogênio em 30 psi. Em seguida, ajuste o regulador de pressão na parte frontal do pulverizador para 10 psi, e ajuste a temperatura do bocal do pulverizador conforme desejado. NOTA: Se a pressão de ar na oração for inferior a 5 psi, o bocal do pulverizador não será capaz de aquecer para proteção.</li>
	<li>Com a válvula ainda na posição LOAD, use uma seringa para lavar o laço com 7 mL de 70% de metanol e, em seguida, encha o laço com 6 mL de matriz.</li>
	<li>Coloque os slides do tecido nos suportes do pulverizador, gravando as duas extremidades para evitar o movimento, e para preservar uma borda livre de matriz para evitar a contaminação do grampo metálico no alvo MALDI pela matriz. NOTA: Testar o spray de matriz em um slide de microscópio em branco primeiro antes de proceder a slides de amostra preciosos é altamente recomendado.</li>
	<li>Verifique se a vazão e a temperatura estão estáveis para começar a pulverizar.</li>
	<li>Selecione o método desejado pré-testado usando slide de vidro em branco.</li>
	<li>Pressione Start. Isso definirá a temperatura do bocal e ajustará a taxa de fluxo da bomba para corresponder ao método selecionado. Mude a válvula da posição Carregar para Spray e confirme clicando em Continuar.</li>
	<li>Permita que o sistema seja executado, o que levará de 5 a 20 minutos por slide, dependendo do método. Mude a válvula da posição Spray para Carregar e confirme clicando em Continuar quando terminar.</li>
	<li>Remova o slide(s) do pulverizador, examine o padrão de revestimento matricial sob microscópio para garantir uma camada uniforme de cristal de matriz fina.</li>
	<li>Após a deposição da matriz, coloque o slide(s) no suporte MALDI metálico para uso imediato. Se houver apenas um slide de amostra, adicione outro slide em branco para preencher os dois espaços do suporte MALDI.</li>
	<li>Limpe o sistema imediatamente após o uso seguindo as instruções do fabricante, para evitar o entupimento do bocal do pulverizador.</li>
	<li>Depois que o slide da amostra for revestido com matriz, proceda imediatamente ao instrumento de imagem MALDI, ou envie-o com gelo seco usando a mesma preparação de saco zip duplo descrito na etapa 2.19. NOTA: Em circunstâncias emergenciais, como o instrumento MALDI não está disponível para uso imediato, armazene o slide revestido em condição de vácuo ou a -20 °C por até 24 horas, embora a deterioração de alguns metabólitos possa acontecer durante o armazenamento, o que não foi exaustivamente estudado.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).</li><li>Miura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahighly+sensitive+in+situ+metabolomic+imaging+for+visualizing+spatiotemporal+metabolic+behaviors.">Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors.</a> Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+metabolomics+using+ultrahigh-field+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 128-140 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N-(1-naphthyl)+ethylenediamine+dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis.">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).</li><li>Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+red+phosphorus+clusters+and+their+use+for+mass+calibration+in+time-of-flight+mass+spectrometry.">Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).</li><li>Schwartz, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) é uma técnica de imagem livre de rótulos que permite aos pesquisadores investigar a distribuição de várias biomoléculas e suas modificações no tecido, a base molecular da patologia. O uso combinado de MALDI-MSI com abordagens tradicionais de LC-MS para análise de tecidos fornece a mesma profundidade molecular que os fluxos de trabalho tradicionais de Omics, mas que também mantém a relação espacial desses sinais dentro da rede celular. A preparação da amostra é o passo mais crítico no MALDI MSI e explica a variação nas leituras finais de estudos metabolômicos realizados em diferentes laboratórios4. Aqui fornecemos um protocolo abrangente, porém prático, para padronizar a preparação da amostra para o perfil metabolômico usando o MALDI MSI, na esperança de que beneficie uma ampla comunidade de pesquisa para implementar o MALDI MSI em suas pesquisas atuais e futuras, desde a biologia básica até estudos translacionais.
Deve-se sempre ter em mente todas as precauções para minimizar as mudanças nos perfis moleculares (tanto abundâncias quanto distribuição espacial) durante as preparações amostrais e evitar contaminação. Em primeiro lugar, minimizar o tempo entre eutanásia animal e colheita de tecidos, como congelado in situ ou aquecido por fixação de micro-ondas para inativar enzimas no cérebro para reduzir a responsabilidade à isquemia pós-morte4,5,6. Em segundo lugar, a condição de congelamento da amostra é crítica. O congelamento inadequado causará a degradação e perda dos metabólitos, enquanto o congelamento excessivo levará à fragmentação tecidual durante a crioseção. O tempo de congelamento deve ser sempre testado primeiro de acordo com estudos relatados anteriormente, e o estudo do cérebro de camundongos de desenvolvimento apresentado neste artigo fornece os pontos de referência para o tecido cerebral de roedores. Em terceiro lugar, o corte de tecidos biológicos e a transferência de suas seções para os slides da OIT exigirão prática adequada. É importante notar que, ao usar o pincel para pegar a seção do palco, o pincel deve ser usado delicadamente. Permita que as cerdas da escova só entrem em contato com as bordas da seção tecidual para diminuir o risco de contaminação e fragmentação da seção. Achate a seção no slide o máximo possível, isso evitará o curling da seção durante o aquecimento dos dedos. Em quarto lugar, durante a montagem no slide ITO, certifique-se de que toda a seção esteja bem ligada ao slide da ITO, pois diferentes regiões do tecido podem exigir diferentes tempos de aquecimento dos dedos. Por exemplo, o tecido tumoral cerebral requer mais tempo de aquecimento do que o tecido cerebral normal. Uma montagem ruim pode levar ao desprendimento e fragmentação do tecido durante a varredura MALDI-MS. Tenha em mente que o aquecimento do dedo pode permitir a ação enzimada e o metabolismo causando alterações artefatosas de metabólitos. Em quinto lugar, uma deposição fina e uniforme da matriz MALDI desempenha um papel importante na obtenção de informações espaciais precisas e forte sinal MALDI-MS. Recomenda-se testar a matriz pulverizando em um slide em branco, e observar o padrão de cristal sob um microscópio para verificar a cobertura adequada, antes de prosseguir para o revestimento de precioso slide de espécime. E por último, uma vez que um pesquisador individual executa a colheita de tecidos e a preparação de slides em velocidades diferentes, seria ideal ter uma pessoa para lidar com a preparação da amostra para a amostra na mesma coorte, para minimizar a variação.
O protocolo fornecido acima detalha os procedimentos padrão, que podem ser adaptados para as necessidades de experimentos específicos. Por exemplo, um gel de crio secção OCT, que normalmente é usado na seção criobito da amostra, pode ser ainda mais utilizado como uma cola de montagem para o mandril de tecido (como no estudo descrito acima). Estudos anteriores mostraram que o componente polímero em OCT causa forte supressão deíons 14. No entanto, a incorporação da amostra pode ser inevitável nos casos em que o tecido é muito frágil para ser cortado sem suporte adicional de um gel de polímero. Para combater a supressão de sinal nesses casos, os tecidos podem precisar ser lavados com lavagem serial em 70% de etanol e 95% de etanol para remover OCT residuais para detecção de proteínas ou lipídios, enquanto a lavagem não é recomendada para a detecção de pequenos metabólitos moleculares9.
O MALDI MSI tem se tornado cada vez mais relevante tanto no laboratório de pesquisa quanto na prática clínica. Por exemplo, o MALDI MSI mostrou-se recentemente útil em estudos de proteômica, a fim de caracterizar o estado funcional fenotípico de um organismo15, e em atuar como agente de identificação e diagnóstico microbiano da doença subsequente16. Embora o MALDI MSI suporte uma ampla gama de aplicações, existem algumas limitações associadas a depender apenas dessa técnica, especialmente quando se trata de diferenciar entre espécies ou metabólitos semelhantes, e a identificação de alvos específicos. Outro desafio é a quantificação da concentração de metabólitos de acordo com os sinais maldi MSI. Presume-se frequentemente que as abundâncias de íons no espectro MALDI MSI e a distribuição espacial (ou abundâncias relativas) de espécies moleculares correspondentes através de tecidos dissecados estão bem correlacionadas. No entanto, deve-se sempre ter em mente que a relação entre a intensidade de íons e a quantidade de espécies moleculares correspondentes é complicada por inúmeros fatores, incluindo, mas não se limitando a, efeitos da supressão de íons, mudanças na estrutura tecidual e reações deion-molécula 17. Técnicas que fazem uso de padrões internos podem ser implementadas para quantificação absoluta (tecido μmol/g) no MALDI-MSI18. Esses dois desafios são tipicamente abordados com o fluxo de trabalho combinado do MALDI MSI com técnicas de cromatografia líquida tandem MS (LC-MS/MS), pelo qual o MALDI-MS permite o mapeamento da região de interesse, que é posteriormente submetida à microextração e LC-MS/MS para fornecer mais informações para identificar o metabólito19.
Os métodos de imagem baseados em MS têm sido desenvolvidos nos últimos anos como uma modalidade alternativa às técnicas anteriores para a imagem de metabólitos de pequenas moléculas. Com os avanços e a crescente popularidade do MALDI MSI, espera-se que a imagem MALDI se torne uma nova ferramenta padrão para visualizar pequenas moléculas. Imagens de pequenas moléculas lipídicas e endógenas (por exemplo, neurotransmissores e metabólitos) no contexto biológico, bem como imagens de xenobióticos para o desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos são de particular interesse. Espera-se que essas três áreas tenham avanços rápidos com a aplicação do MALDI MSI no próximo futuro20.

Metabólitos, intermediários ou produtos finais do metabolismo, incluindo nucleotídeos, amino ou ácidos orgânicos, lipídios, são componentes-chave para funções e processos biológicos. Metabolômica, o estudo dos metabólitos, permite a exploração de suas interações bioquímicas e a compreensão de seus papéis no contexto da pesquisa básica, translacional e clínica. Metabólitos estão fortemente associados aos fenótipos dos organismos e fornecem informações sobre atividades bioquímicas que ocorrem durante o metabolismo celular1. Portanto, além da genômica e da proteômica, a metabolômica surgiu como uma importante ferramenta na compreensão das condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, a metabolômica é usada para elucidar os mecanismos por trás das drogas existentes, bem como sua tolerância. No desenvolvimento de medicamentos, o metabolismo xenobiótico é útil na avaliação da atividade ou toxicidade de metabólitos entre espécies, o que mais tarde se traduz em apoiar a medicina personalizada2. Apesar da ampla aplicação da metabolômica, a imagem de metabólitos pode ser desafiadora devido à reatividade química dos metabólitos, heterogeneidade estrutural e ampla faixa de concentração3. No entanto, as concentrações de metabólitos labile, incluindo compostos de alta energia, glicose, lactato, glicóltico, pentose shunt pathway, e intermediários de ciclo TCA, fosfolipídios, neurotransmissores, compostos de sinalização, podem mudar em segundos e progredir ao longo de minutos quando enzimas teciduais estão ativas durante procedimentos de colheita de tecidos, como isquemia pós-morte na colheita cerebral4,5,6 . Para garantir a aquisição precisa de dados metabolômicos, a preparação adequada e cuidadosa da amostra é fundamental7,8. As plataformas estabelecidas atuais para medir metabólitos incluem RMN, ensaios enzimáticos e espectrometria de massa (incluindo cromatografia líquida e gasosa), a última das quais é discutida mais abaixo.
MALDI-MSI é uma técnica de última geração que permite a análise de amostras complexas através da detecção de espécies moleculares individuais. Maldi MSI concede o benefício de ser capaz de medir rapidamente e reprodutivelmente vários compostos moleculares em amostras biológicas. A imagem de espectrometria em massa permite ainda a produção de imagens que representam a biologia tecidual com base em seus metabólitos compostos, e o faz preservando a distribuição espacial dos metabólitos na amostra9. A capacidade do MALDI de detectar analitos em uma amostra sem o uso de rotulagem de anticorpos, modificações estruturais ou outros reagentes especializados, como os usados em imunossagens, juntamente com sua capacidade de monitorar centenas de moléculas dentro de um único experimento compreendem apenas algumas das vantagens que a imagem em MS concede quando se trata de perfil metabólico10, 11. Além de matriz comumente utilizada como ácido dihidroxibenómico 2,5 -DIhydroxybenzoic (DHB) e 9-aminoacridina (9-AA), recentemente descoberta nova matriz N -(1-Nafthil) Dihidrocloide de Etilladiamina (NEDC), que é bem adequado para análises de vários metabólitos de baixo peso molecular, melhorou ainda mais a aplicação do MALDI MSI no perfil metabólico12.
Apesar da ampla aplicação do MALDI MSI, o alto custo do instrumento e a complexidade do procedimento experimental impedem sua implementação mais ampla em laboratórios de pesquisa individuais. Portanto, a maioria dos estudos maldi MSI são suportados através de instalações de núcleo compartilhado. A preparação da amostra, incluindo preparação de slides e revestimento de matriz, é o passo mais crítico no MALDI MSI. No entanto, a preparação do slide é normalmente realizada no laboratório individual do pesquisador, o que cria potenciais variações na aquisição posterior do MSI maldi. Aqui, pretendemos fornecer um protocolo detalhado para a preparação amostral de amostras biológicas antes de prosseguir para as medições maldi MSI, e usar um perfil metabolômico do cérebro do rato de desenvolvimento como exemplo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

Metabolômica, o estudo para identificar e quantificar pequenas moléculas e metabólitos presentes em uma amostra experimental, emergiu como uma importante ferramenta para investigar as atividades biológicas durante o desenvolvimento e doenças. As abordagens metabolômicas são amplamente utilizadas no estudo do câncer, nutrição/dieta, diabetes e outras condições fisiológicas e patológicas envolvendo processos metabólicos. Uma ferramenta vantajosa que auxilia no perfil metabolômico defendido neste artigo é a desorção/espectrometria de massa assistida por matriz /ionização (MALDI MSI). Sua capacidade de detectar metabólitos in situ sem rotulagem, modificações estruturais ou outros reagentes especializados, como os utilizados na imunossão, torna o MALDI MSI uma ferramenta única no avanço de metodologias relevantes no campo da metabolômica. Um processo adequado de preparação da amostra é fundamental para produzir resultados ideais e será o foco deste artigo.

O experimento representativo foi realizado de acordo com o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1. Os cérebros de camundongos de desenvolvimento C57BL do pós-natal dia 1, 21, 60 (adulto) foram colhidos conforme descrito acima seguindo as diretrizes do CUNY IACUC e foram congelados por 2, 5 e 7 minutos, respectivamente, em um barco de alumínio flutuando em nitrogênio líquido. Os tecidos congelados foram criosecionados a seções de espessura de 10 μm a -15 °C para a cabeça do espécime e para a câmara. As crioseções teciduais foram então gentilmente transferidas para o lado condutor pré-resfriado de lâminas de vidro revestidas de ITO para imagens MALDI. As crioseções montadas nos slides do ITO foram dessecadas no vácuo por 45 minutos à temperatura ambiente, seguidas pela deposição matricial usando pulverizador automático de matriz. Matrix NEDC foi utilizado para detectar metabólitos, e uma solução matricial de 10 mg/mL em metanol/água (70/30, v/v) foi depositada a uma taxa de fluxo de 0,1 mL/min e uma temperatura de bico de 75 °C para 12 ciclos com secagem de 5 s entre cada ciclo. Foi utilizada uma velocidade de pulverização de 1300 mm/min, espaçamento de 2 mm, pressão gasosa N2 de 10 psi e vazão de 3 L/min e altura do bocal de 40 mm.
Os espectros de massa MALDI foram adquiridos no modo íon negativo pelo instrumento MSI tempo de voo MALDI (TOF). 0,5-1 μL de fósforo vermelho (agrupamentos pn com n = 1 - 90) emulsão em metanol foi depositado nos slides do ITO, ao lado dos tecidos montados, e usado para calibrar o instrumento na faixa de massa de 100 - 1000 m/z, aplicando curva de calibração quadrática13. Os diâmetros da mancha de laser foram focados no perfil do feixe modulado "Médio" para largura de raster de 50 μm. Espectros dentro da faixa de massa de m/z 50 a 1000 foram adquiridos a 1000 Hz para 500 shots. Os dados de espectros em massa foram registrados, e a imagem foi ainda analisada utilizando-se de um software avançado de análise de dados MALDI MSI. As imagens de íon foram geradas com a normalização do quadrado de raiz (RMS) em uma largura de lixeira de ±0,25 Da.
Os resultados da Figura 2 mostram imagens de saída do software de análise de dados MALDI MSI de espectros m/z selecionados a cada intervalo de 100 Dalton, representando claramente a utilidade para identificação de espectros de metabólitos de moléculas pequenas a lipídios de alto peso molecular. Cada linha retrata os respectivos mapas de calor de íons contendo informações espaciais e espectrais de uma determinada espécie metabólica em três tecidos coletados nos dias 1, 21 e 60 pós-natal. Para cada representante m/z, a análise da distribuição regional e das abundâncias de íons pode ser utilizada para comparar quantidades relativas de espécies correspondentes entre diferentes idades. Uma força da metodologia MALDI MSI é a capacidade de discernir a especificidade de determinadas espécies identificadas por m/z para marcos de desenvolvimento ou estruturas anatômicas específicas. Alguns metabólitos são observados para serem enriquecidos em recém-nascidos P1 (m/z 320,1), enriquecidos em adultos P60 (m/z 846,5) ou distribuídos uniformemente entre idades (m/z 480,3); outras espécies moleculares são especificamente enriquecidas em matéria cinzenta (m/z 117,1; 524,3; 765,1), matéria branca (m/z 673,4; 846,5) ou CSF/ventrículos (m/z 239,0)(Figura 2A). A distribuição espacial de metabólitos representativos incluindo hipoxantina (m/z 135,0), ácido N-Acetil-L-aspartic (m/z 174.0), ácido aracidônico (m/z 303.2), e vários lipídios como lisofosphatidylethanolamina LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(2 00:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfattidyletanolamina PE (44:6 10) (m/z 838,5), Fosphatidylinositol PI (38:4) (m/z 885,6) também são mostrados(Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Figura 1. Fluxo de trabalho de imagens de espectrometria de massa MALDI-time of flight (TOF). O tecido congelado é criuado em criostat e montado no slide ITO. → O slide com seções de tecido é revestido com uma fina camada de matriz usando pulverizador de matriz automático. → espectros de massa é coletado pelo instrumento MALDI-TOF MSI em um raster de 20-200um. → Os dados são analisados e as imagens são geradas usando um software avançado de análise de dados MALDI MSI. Barra de escala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Figura 2. Saída representativa com espectrotrais m/z selecionados da espectrometria de massa adquirida a resolução lateral de 50 μm. (A) Um mapa de calor retrata a distribuição espacial de espécies metabólitos específicas selecionadas a cada intervalo de 100 Dalton m/z através dos três marcos de desenvolvimento identificados em P1, P21 e P60. (B) Distribuição espacial de metabólitos representativos em P1, P21 e P60, incluindo: hipoxantina, ácido N-Acetil-L-aspartic, ácido aracidonico e diferentes espécies lipídicas como lisofosofosphatidylethanolamina (LPE), fosfatidylethanolamina (PE), Fosfatidylinositol (PI). Barra de escala, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação da amostra ao planejar experimentos usando MALDI MSI para maximizar a detecção metabólica e molecular em amostras biológicas.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K visualizações.  The City University of New York. O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação da amostra ao planejar experimentos usando MALDI MSI para maximizar a detecção metabólica e molecular em amostras biológicas. 

Vídeo: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amida de hidrogênio / deutério Exchange &amp; MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Os nódulos radiculares

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...