Ye He ve Rinat Abzalimov, New York Şehir Üniversitesi (PSC-CUNY) Araştırma Ödül Programı tarafından desteklenmektedir. Yuki Chen ve Kelly Veerasammy, Alfred P. Sloan Vakfı CUNY Yaz Lisans Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.

Protokol, New York Şehir Üniversitesi (CUNY) İleri Bilim Araştırma Merkezi'nin (ASRC) kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin (IACUC) yönergelerini takip ediyor.
1. Dokuyu hasat edin
<ol><li>Alüminyum tekneyi hazırlayın. Dikdörtgen alüminyum 10cm x 20 cm hazırlayın, 10 cm çift katmanlı kare yapmak için ortada katlayın. Örnek bilgileri bir tarafa etiketlenin ve alt yüzeyi yaklaşık 4 cm x 4 cm olan bir tekne oluşturmak için diğer tarafı katlayın.</li>
	<li>Tekneyi sıvı nitrojen (LN2)üzerinde bir strafor kutusunda ön soğutma. NOT: Tekne çok küçükse, numune tekneden düşebilir ve doğrudan LN2ile iletişime geçerek donmuş olabilir, bu da kriyoseksiyon sırasında parçalanmaya neden olabilir.</li>
	<li>Kurumsal IACUC yönergelerini izleyerek hayvanı servikal çıkık ile ötenazi yapın, hemen ilgi dokusunu parçalara çıkarın.<ol>
<li>Doku hasadı sırasında metabolitlerin, özellikle de ölüm sonrası iskemi nedeniyle beyindeki labial metabolitlerin değişimini en aza indirmek için hayvan anestezisi ve çıtçıt dondurma arasındaki aralığı mümkün olduğunca kısa tutun. NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS) ile hayvanın perfüzyonu iskemi süresini artıracak, labile metabolit konsantrasyonlarını daha da değiştirecek ve artekötik sonuçları abartacaktır. Bu nedenle, kan veya vücut sıvısının kirlenmesi, bireysel proje için metabolitlerin bozulmasından veya yıkanmasından daha fazla endişe edilmediği sürece, dokunun PBS ile perfüzyonu veya yıkanması önerilmez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen dokuyu sıvı nitrojen üzerinde yüzen alüminyum tekneye yerleştirin, strafor kutusunun kapağını kapatın ve dokunun boyutuna bağlı olarak 2-10 dakika dondurun: doğum sonrası 1 (P1), P21, P60 fare beyni için sırasıyla 2 dk, 5 dk, 7 dk ve P60 sıçan beyni için 10 dk. NOT: Aşırı donmuş kriyoseksiyon sırasında doku parçalanmasına yol açabileceğinden, dokuyu uzun süre (örneğin, P1 fare beyni için 5 dk) dondurmayın.</li>
	<li>Tekneyi forsepsle çıkarın, dokuyu sarmak için folyoyu katlayın, kuru buz üzerinde taşıyın ve daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın. Hemen kesitle takip edilirse, kuru buz üzerindeki örnekleri kriyostat'a taşıyın. NOT: Metabolitleri daha iyi korumak için, NUMUNENIN MALDI görüntülemeye geçmeden hemen önce sağlam dokuda ve bölümde saklanması tercih edilir. Doku -80 °C'de 24 aya kadar saklanabilir.</li>
</ol>2. Doku kriyoseksiyon
NOT: Indium tinoxide (ITO) slaytlarını kullanırken her zaman eldiven giyin. İnsan tükürüğünün doku bölümüne bulanmasını önlemek için kaydırağa doğrudan nefes almaktan kaçının veya maske takın (isteğe bağlı).
<ol><li>Dokuyu bölümlemeden önce, istediğiniz sayıda MALDI uyumlu ITO kaplı cam kaydırak toplayın.</li>
	<li>Direnç olarak ayarlanmış bir voltmetre kullanarak slaydın iletkenliğini test edin. Direnç ölçümünün okunduğu tarafı etiketle: Bu, doku bölümlerinin yapışdığı taraf olacaktır. Kirlenmeyi önlemek için kaydırağı her zaman temiz bir kağıt havluya yerleştirin.</li>
	<li>Slaytları -20 °C'ye ayarlanmış bir kriyostatta önceden soğutun.</li>
	<li>Doku örnekleri -80 °C'den çıkarılmışsa, dokunun büyüklüğüne bağlı olarak yaklaşık 45-60 dakika kriyostat odasında dokuya dengeyi sağla. Numuneler kuru buzdan çıkarılıyorsa, yaklaşık 30 dakika boyunca dengeyi kurutun.</li>
	<li>Kriyostatı% 70 etanol ile iyice temizleyin. Kriyostat odasında ince uçlu sanatçı fırçası ve tostu da dahil olmak üzere gerekli tüm aletleri önceden soğutun.</li>
	<li>Kriyostat odasının ve numune kafasının sıcaklığını dokunun türüne göre ayarlayın: karaciğer için -14 °C, kas için -20 °C ve cilt için -25 °C9.</li>
	<li>Bileşik OCT gömen kriyo dokusunu kullanarak dokuyu aynaya monte edin, ilgi çekici bölgeden OCT'den kaçının.</li>
	<li>Sahne alanına temiz bir bıçak yerleştirin ve kilitleyin. İstenilen kesme açısını elde etmek için sahnenin konumunu ve numunenin açısını ayarlayın. NOT: Farklı doku tipleri/genotipleri kesilecekse, bıçağın temiz bir parçasının kullanılması için numuneyi yeniden konumlandırdığınızı veya çapraz kontaminasyonu önlemek için bir sonraki örneği kesmeden önce yeni bir bıçağa değiştirdiğinizden emin olun.</li>
	<li>İlgi alanı (örneğin, beyindeki corpus callosum) bulunana kadar kesmeye devam edin. Kriyostatta dengelenmiş bir sanatçı fırçası ile ekstra parçaları fırçalayarak sahneyi temiz tuttuğunuzdan emin olun.</li>
	<li>İstenilen bölge ortaya çıktıktan sonra, 10-12 μm kalınlığında daha küçük bölümler kesin. Bölüm kolayca pullanma veya parçalanma eğilimindeyse, -22 °C ila -11 °C aralığında kalarak kriyostatın sıcaklığını yükseltin. Beyin dokusu için en uygun kesme sıcaklığının -15 °C ila - 18 °C olduğunu bulduk.</li>
	<li>İyi bir bölüm kesildikten sonra, ITO slaydına yapışın (kriyostat odasında çalıştırın).</li>
	<li>Dokuların bir bölümünü sanatçı fırçasının ucunu kullanarak ITO slaytlarına aktarın.</li>
	<li>Güvenli montaj sağlamak için bölümü ısıtmak için slaydın altına bir parmak yerleştirerek bölümü parmakla ısıtın. Doku bölümü önce 5-10 s'de şeffaf hale gelecek ve daha sonra yaklaşık 30-60 s'de opak hale gelecektir.</li>
	<li>Slaytı kriyostatta dikkatlice bir kenara koyun.</li>
	<li>Diğer doku örnekleri için adımları tekrarlayın, dokunun her bölümünün kaydırağın üzerine eşit olarak yerleştirildiklerinden ve mümkün olduğunca hizalı olduğundan emin oluruz.</li>
	<li>MALDI hedefi en fazla iki slayt tutabildiğinden, aynı kohordun birden fazla örneğinden bölümleri tek bir slayta veya iki slayta yerleştirin, böylece aynı anda analiz edilebilmelerini sağlayın.</li>
	<li>İşiniz bittiğinde, ITO slaytlarını bir vakum kutusuna yerleştirin ve kurutuculu bir kurutucuya aktarın. Kaydırağı 45-60 dakika vakumla kurulayın. NOT: Laboratuvarda bir vakum kurutucu yoksa, metabolitlerin bozulmasını önlemek için slaytları her zaman -20 °C'nin altında tutun.</li>
	<li>Slayt depolama ve nakliye: Numune, MALDI görüntüleme çekirdek tesisleri tarafından doğrudan MALDI görüntülemesine devam etmek için hazırlanmadığı sürece, slaytları -80 °C'de saklayın veya kuru buz üzerinde çekirdek tesislere veya diğer MALDI araştırma laboratuvarlarına sevk edin.</li>
	<li>Numuneleri en iyi şekilde korumak için, slaytları slayt taşıyıcısına yerleştirin, azotla doldurun (isteğe bağlı), parafilm ile kapatın, bir zip torbasına yerleştirin, daha sonra kurutucu içeren başka bir zip torbasına yerleştirilir. Dış fermuar çantasını etiketle.</li>
	<li>-80 °C'de (6 aya kadar) depolamaya veya yeterli kuru buzla nakliyeye devam edin.</li>
</ol>3. Matris Hazırlama
<ol><li>Matrisi hazırlayın. NOT: Tüm reaktifler HPLC sınıfı olmalıdır.<ol>
<li>NEDC'i 10 mg/mL konsantrasyonda hazırlayın. % 70 metanol çözücüde çözünmüş 10 mL matris hazırlayın (100 mg NEDC, 7 mL metanol, 3 mL H2O).</li>
		<li>Ayrıca matrisi doldurmadan önce püskürtücü sistemini yıkamak için ekstra 10 mL%70 metanol:su çözeltisi hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.17. adımda slaytlar susuz kaldıktan sonra, kalın nokta gümüş işaretçisi kullanarak doku bölümlerinin dışındaki cam slaytın boş alanına "X" işaretleri yerleştirin ve ardından gümüş "X" nin üzerine ince nokta siyah işaretleyicili ikinci bir "x" yerleştirin. Gümüş arka plan dışında keskin bir kontrasta sahip siyah "X" (cesur gümüş "X") daha sonra MALDI enstrümanında daha sonraki kütle spektrumu alımı için güven verici bir işaret görevi görecektir.</li>
	<li>Slaydı MALDI slayt metal hedefine yükleyin. Plastik kapak kullanın ve numunelerin plastik kapağın üzerine olduğu yeri çizin / çizin. Kenara.</li>
	<li>Düz yataklı tarayıcı kullanarak slaytın görüntüsünü MALDI hedefiyle birlikte tarayın. Hedefin yüzeyindeki vidalar, doku bölümünün tarayıcı tarafından hasar görmesini veya kirlenmesini önlemek için aralayıcı görevi görecektir. Seçili slayt alanını 16 bit gri tonlamalı ve 2400 dpi olarak önizleyin ve tarayın. Görüntüyü daha sonra MALDI MSI'da kullanmak üzere kaydedin.</li>
</ol>4. Matris ifadesi
NOT: MALDI slaydına ince kristal boyutunda çift matris katmanı uygulamak için süblimasyon, damlacık mürekkep püskürtmeli baskı, otomatik matris püskürtücü ve sanatçı airbush9kullanarak manuel sprey dahil olmak üzere birden fazla yöntem vardır. Yüksek tekrarlanabilirliği için bu protokolde örnek olarak otomatik matris püskürtücü kullanacağız.
<ol><li>Başlatma: Valfin LOAD'a konumlandırıldığından emin olarak matris püskürtücü ünitesini açın ve püskürtücü yazılımını başlatın. Egzoz fanı iyi çalışıyor olup olmadığını kontrol edin. Aktif havalandırma düzgün çalışmıyorsa çözücü pompayı çalıştırmayın.</li>
	<li>İletişim sekmesinde her şeyin iletişim kurduğunu onaylayın ve ardından çözücü pompayı ~500 psi (veya 3,4 MPa) geri basınçla .1 mL /dak'da başlatın.</li>
	<li>Azot tankını 30 psi'ye ayarlayarak matris püskürtücüye basınçlı hava akışını başlatın. Ardından, püskürtücünün ön önü üzerindeki basınç regülatörü 10 psi'ye ayarlayın ve püskürtücü nozül sıcaklığını istediğiniz gibi ayarlayın. NOT: Namazda hava basıncı 5 psi'den düşükse, püskürtücü nozül koruma için ısınamaz.</li>
	<li>Valf hala LOAD konumundayken, döngüyü% 70 metanol 7 mL ile yıkamak için bir şırınna kullanın ve ardından döngüyü 6 mL matrisle doldurun.</li>
	<li>Hareketi önlemek için her iki ucunun da bantlanarak ve METAL KELEPÇENIN MALDI hedefi üzerindeki matris tarafından kirlenmesini önlemek için matrissiz bir kenarı korumak için doku slaytlarını püskürtücüdeki tutuculara yerleştirin. NOT: Değerli numune slaytlarına geçmeden önce matris spreyin boş bir mikroskop kaydıraktan test etmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>Püskürtmeye başlamak için akış hızının ve sıcaklığın stabil olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Boş cam slayt kullanılarak önceden test edilmiş istenen yöntemi seçin.</li>
	<li>Başlat 'abasın. Bu, nozul sıcaklığını ayarlar ve pompa akış hızını seçilen yönteme uyacak şekilde ayarlar. Vanayı Yükle'den Sprey konumuna geçirin ve Devam'ı tıklatarak onaylayın.</li>
	<li>Yönteme bağlı olarak slayt başına 5-20 dakika sürecek sistemin çalışmasına izin verin. Vanayı Sprey'den Yük konumuna geçirin ve tamamlandığında Devam'ı tıklatarak onaylayın.</li>
	<li>Slaytları püskürtücüden çıkarın, ince matris kristalinin eşit bir tabakasını sağlamak için mikroskop altında matris kaplama desenini inceleyin.</li>
	<li>Matris biriktirmeden sonra, slaytları hemen kullanmak üzere metal MALDI tutucuya yerleştirin. Yalnızca bir örnek slayt varsa, MALDI tutucunun iki alanını doldurmak için başka bir boş slayt ekleyin.</li>
	<li>Püskürtücü nozülün tıkanmasını önlemek için, üreticinin talimatını takiben kullanımdan hemen sonra sistemi temizleyin.</li>
	<li>Örnek slayt matrisle kaplandıktan sonra, hemen MALDI görüntüleme cihazına ilerleyin veya adım 2.19'da açıklanan çift fermuarlı torba hazırlığını kullanarak kuru buzla sevk edin. NOT: MALDI cihazı gibi acil durumlarda, kaplamalı slaydı vakum durumunda veya -20 °C'de 24 saate kadar saklayın, ancak depolama sırasında bazı metabolitlerin bozulması meydana gelebilir, bu da kapsamlı bir şekilde incelenmemiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography-mass+spectrometry+based+global+metabolite+profiling:+a+review.">Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review.</a> Analytica Chimica Acta. 711, 7-16 (2012).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+Imaging+Mass+Spectrometric+Assays+of+Labile+Brain+Metabolites:+Critical+Importance+of+Brain+Harvest+Procedures.">Metabolomic and Imaging Mass Spectrometric Assays of Labile Brain Metabolites: Critical Importance of Brain Harvest Procedures.</a> Neurochemistry Research. 45, 2586-2606 (2020).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+Assays+of+Postmortem+Brain+Extracts:+Pitfalls+in+Extrapolation+of+Concentrations+of+Glucose+and+Amino+Acids+to+Metabolic+Dysregulation+In+Vivo+in+Neurological+Diseases.">Metabolomic Assays of Postmortem Brain Extracts: Pitfalls in Extrapolation of Concentrations of Glucose and Amino Acids to Metabolic Dysregulation In Vivo in Neurological Diseases.</a> Neurochemistry Research. 44, 2239-2260 (2019).</li><li>Wasek, B., Arning, E., Bottiglieri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microwave+irradiation+for+quantitative+analysis+of+neurotransmitters+in+the+mouse+brain.">The use of microwave irradiation for quantitative analysis of neurotransmitters in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 188-193 (2018).</li><li>Andres, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflow+for+mass+spectrometry-based+metabolomics+analysis+of+the+heart.">Improved workflow for mass spectrometry-based metabolomics analysis of the heart.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 2676-2686 (2020).</li><li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+Measurement:+Pitfalls+to+Avoid+and+Practices+to+Follow.">Metabolite Measurement: Pitfalls to Avoid and Practices to Follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113, 2309-2342 (2013).</li><li>Miura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahighly+sensitive+in+situ+metabolomic+imaging+for+visualizing+spatiotemporal+metabolic+behaviors.">Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors.</a> Analytical Chemistry. 82, 9789-9796 (2010).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-throughput+metabolomics+using+ultrahigh-field+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Towards high-throughput metabolomics using ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 128-140 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N-(1-naphthyl)+ethylenediamine+dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis.">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Analytical Chemistry. 87, 422-430 (2015).</li><li>Sladkova, K., Houska, J., Havel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+red+phosphorus+clusters+and+their+use+for+mass+calibration+in+time-of-flight+mass+spectrometry.">Laser desorption ionization of red phosphorus clusters and their use for mass calibration in time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19, 3114-3118 (2019).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38, 699-708 (2003).</li><li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15, 683-696 (2018).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Hankin, J. A., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+MALDI+IMS+intensity+and+measured+quantity+of+selected+phospholipids+in+rat+brain+sections.">Relationship between MALDI IMS intensity and measured quantity of selected phospholipids in rat brain sections.</a> Analytical Chemistry. 82 (20), 8476-8484 (2010).</li><li>Prentice, B. M., Chumbley, C. W., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Quantification+of+Rifampicin+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+Using+Multiple+TOF/TOF+Events+in+a+Single+Laser+Shot.">Absolute Quantification of Rifampicin by MALDI Imaging Mass Spectrometry Using Multiple TOF/TOF Events in a Single Laser Shot.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (1), 136-144 (2017).</li><li>Quanico, J., Franck, J., Wisztorski, M., Salzet, M., Fournier, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MALDI+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Parafilm-Assisted+Microdissection-Based+LC-MS/MS+Workflows+in+the+Study+of+the+Brain.">Combined MALDI Mass Spectrometry Imaging and Parafilm-Assisted Microdissection-Based LC-MS/MS Workflows in the Study of the Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1598, 269-283 (2017).</li><li>Trim, P. J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI), araştırmacıların patolojinin moleküler temeli olan çeşitli biyomoleküllerin dağılımını ve dokudaki modifikasyonlarını araştırmalarını sağlayan etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. MALDI-MSI'ın doku analizi için geleneksel LC-MS yaklaşımlarıyla birlikte kullanılması, geleneksel Omics iş akışlarıyla aynı moleküler derinliği sağlar, ancak aynı zamanda bu sinyallerin hücresel ağ içindeki mekansal ilişkisini de korur. Örnek hazırlık, MALDI MSI'daki en kritik adımdır ve farklı laboratuvarlarda yürütülen metabolomik çalışmaların son okumalarındaki varyasyonu hesaplar4. Burada, temel biyolojiden çeviri çalışmalarına kadar mevcut ve gelecekteki araştırmalarında MALDI MSI'ı uygulamak için geniş bir araştırma topluluğuna fayda sağlaması umuduyla, MALDI MSI kullanarak metabolomik profilleme için örnek hazırlığı standartlaştırmak için kapsamlı ama pratik bir protokol sunuyoruz.
Numune preparatları sırasında moleküler profillerdeki değişiklikleri (hem bolluk hem de mekansal dağılım) en aza indirmek ve kirlenmeyi önlemek için her zaman tüm önlemleri göz önünde bulundurmalıdır. İlk olarak, hayvan ötenazisi ile doku hasadı arasındaki süreyi en aza indirin, örneğin donmuş yerinde veya mikrodalga fiksasyonu ile ısıtılarak beyindeki enzimleri inaktive etmek için ölüm sonrası iskemi 4,5,6. İkincisi, numunenin çıtçıt dondurma durumu kritiktir. Yetersiz donma metabolitlerin bozulmasına ve kaybına neden olurken, aşırı donma kriyoseksiyon sırasında doku parçalanmasına yol açacaktır. Donma süresi her zaman önce bildirilen çalışmalara göre test edilmelidir ve bu makalede sunulan gelişimsel fare beyninin çalışması kemirgen beyin dokusu için referans noktaları sağlar. Üçüncü olarak, biyolojik dokuların kesilmesi ve bölümlerinin İTO slaytlarına aktarılması yeterli uygulamayı gerektirecektir. Bölümü sahneden almak için fırçayı kullanırken, fırçanın hassas bir şekilde kullanılması gerektiğini unutmayın. Kontaminasyon ve kesit parçalanma riskini azaltmak için fırça kıllarının sadece doku bölümünün kenarlarıyla temas etmesine izin verin. Slayttaki bölümü mümkün olduğunca düzleştirin, bu parmak ısınması sırasında bölümün kıvrılmasını önleyecektir. Dördüncü olarak, ITO slaydına monte edilirken, dokunun farklı bölgeleri farklı parmak ısınması zamanı gerektirebileceğinden, tüm bölümün ITO kaydırağında iyi takıldığından emin olun. Örneğin, beyin tümörü dokusu normal beyin dokusundan daha uzun ısınma süresi gerektirir. Kötü bir montaj, MALDI-MS taraması sırasında dokunun kopmasına ve parçalanmasına neden olabilir. Parmak ısınmasının enzim etkisini ve metabolitlerin artektual değişikliklerine neden olan metabolizmayı sağlayabileceğini unutmayın. Beşinci olarak, MALDI matrisinin ince ve düzgün bir şekilde birikmesi, doğru mekansal bilgi ve güçlü MALDI-MS sinyali elde etmede önemli bir rol oynar. Değerli numune kaydırasının kaplamasına geçmeden önce matris püskürtmenin boş bir slaytta test etmesi ve uygun kapsama alanını doğrulamak için kristal desenini mikroskop altında gözlemlemeniz önerilir. Ve son olarak, bireysel bir araştırmacı doku toplama ve kayma hazırlığını farklı hızlarda yürüttüğünden, varyasyonu en aza indirmek için numunenin numune hazırlığını aynı kohortta ele almak için bir kişinin olması ideal olacaktır.
Yukarıda verilen protokol, belirli deneylerin ihtiyaçlarına göre uyarlanabilen standart prosedürleri detaylandırmaktadır. Örneğin, normalde numunenin kriyo kesitinde kullanılan bir kriyo-kesitleme jeli OCT, doku aynasına bir montaj tutkalı olarak daha fazla kullanılabilir (yukarıda açıklanan çalışmada olduğu gibi). Önceki çalışmalar, OCT'deki polimer bileşeninin güçlü iyon bastırmaya neden olduğunu göstermiştir14. Bununla birlikte, dokunun polimer jelden ek destek almadan kesilemeyecek kadar kırılgan olduğu durumlarda numunenin gömülmesi kaçınılmaz olabilir. Bu durumlarda sinyal bastırma ile mücadele etmek için, dokuların proteinlerin veya lipitlerin tespiti için artık OCT'yi çıkarmak için% 70 etanol ve% 95 etanolde seri yıkama ile yıkanması gerekebilir, yıkama ise küçük moleküler metabolitlerin tespiti için önerilmez9.
MALDI MSI, hem araştırma laboratuvarı hem de klinik uygulama ortamında giderek daha alakalı hale gelmiştir. Örneğin, MALDI MSI son zamanlarda bir organizmanın fenotipik fonksiyonel durumunu karakterize etmek için proteomik çalışmalarda yararlı olduğunu kanıtlamıştır15ve sonraki hastalığın mikrobiyal tanımlanması ve teşhisi için bir ajan olarak hareketetme 16. MALDI MSI çok çeşitli uygulamaları desteklerken, özellikle benzer türler veya metabolitler arasında ayrım yapmak ve belirli hedeflerin tanımlanması söz konusu olduğunda, yalnızca bu tekniğe güvenmekle ilgili bazı sınırlamalar vardır. Diğer bir zorluk, metabolit konsantrasyonunun MALDI MSI sinyallerine göre ölçülmesidir. Genellikle MALDI MSI spektrumlarındaki iyon bolluklarının ve incelenmiş dokular arasında karşılık gelen moleküler türlerin mekansal dağılımının (veya göreceli bolluklarının) iyi ilişkili olduğu varsayılır. Bununla birlikte, iyon yoğunluğu ve karşılık gelen moleküler türlerin miktarı arasındaki ilişkinin, iyon bastırmanın etkileri, doku yapısındaki değişiklikler ve iyon molekül reaksiyonları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda faktör tarafından karmaşık olduğunu her zaman akılda tutarız17. MALDI-MSI18'demutlak niceleme (μmol/g doku) için iç standartlardan yararlanılan teknikler uygulanabilir. Bu iki zorluk tipik olarak MALDI MSI'ın sıvı kromatografi tandem MS (LC-MS/MS) teknikleri ile birleştirilmiş iş akışı ile ele alınır, böylece MALDI-MS, daha sonra metabolit19'utanımlamak için daha fazla bilgi sağlamak için mikroextraction ve LC-MS / MS'e tabi tutulan ilgi alanının haritalanmasına izin verir.
MS tabanlı görüntüleme yöntemleri son yıllarda küçük molekül metabolitlerinin görüntülenmesinde önceki tekniklere alternatif bir yöntem olarak geliştirilmiştir. MALDI MSI'ın ilerlemesi ve artan popülaritesi ile MALDI görüntülemenin küçük molekülleri görselleştirmek için yeni bir standart araç haline gelmesi beklenmiştir. Lipid ve endojen küçük moleküllerin (örneğin nörotransmitterler ve metabolitler) biyolojik bağlamda görüntülenmesi ve yeni farmasötik ajanların gelişimi için ksenobiyotiklerin görüntülenmesi özellikle ilgi çekicidir. Bu üç alanın yakın gelecekte MALDI MSI uygulaması ile hızlı ilerlemeler olması beklenmektedir20.

Metabolitler, nükleotitler, amino veya organik asitler, lipitler de dahil olmak üzere metabolizmanın ara ürünleri veya son ürünleri, biyolojik fonksiyonların ve süreçlerin temel bileşenleridir. Metabolitlerin çalışması olan metabolomics, biyokimyasal etkileşimlerinin araştırılmasına ve temel, çevirisel ve klinik araştırmalar bağlamında rollerinin anlaşılmasına izin verir. Metabolitler organizmaların fenotipleri ile güçlü bir şekilde ilişkilidir ve hücresel metabolizma sırasında meydana gelen biyokimyasal aktiviteler hakkında bilgi sağlar1. Bu nedenle, genomik ve proteomiklere ek olarak, metabolomik hem fizyolojik hem de patolojik durumları anlamada önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, metabolomik, mevcut ilaçların arkasındaki mekanizmaların yanı sıra toleranslarını da aydınlatırken kullanılır. İlaç geliştirmede, ksenobiyotik metabolizma, metabolitlerin türler arasında aktivitesini veya toksisitesini değerlendirmede yararlıdır, bu da daha sonra kişiselleştirilmiş tıbbı desteklemeye dönüşür2. Metabolomiklerin geniş uygulamasına rağmen, metabolitlerin kimyasal reaktivitesi, yapısal heterojenliği ve geniş konsantrasyon aralığı3nedeniyle metabolitlerin görüntülenmesi zor olabilir. Bununla birlikte, yüksek enerji bileşikleri, glikoz, laktat, glikolit, pentoz şant yolu ve TCA döngüsü ara maddeleri, fosfolipidler, nörotransmitterler, sinyal bileşikleri dahil olmak üzere labile metabolitlerinin konsantrasyonları saniyeler içinde değişebilir ve beyin hasadında ölüm sonrası iskemi gibi doku enzimleri aktif olduğunda dakikalar içinde ilerleyebilir4,5,6 . Doğru metabolomik veri alımını sağlamak için uygun ve dikkatli numune hazırlama kritiktir7,8. Metabolitleri ölçmek için mevcut yerleşik platformlar arasında NMR, enzim tahlilleri ve kütle spektrometresi (sıvı ve gaz kromatografisi dahil) bulunmaktadır ve bunlardan sonuncusu aşağıda daha fazla tartışılmaktadır.
MALDI-MSI, karmaşık örneklerin bireysel moleküler türlerin tespiti yoluyla analiz edilmesine izin veren son teknoloji ürünü bir tekniktir. MALDI MSI, biyolojik numunelerdeki çeşitli moleküler bileşikleri hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçebilme avantajı sağlar. Kütle spektrometresi görüntüleme ayrıca kompozit metabolitlerine dayanarak doku biyolojisini temsil eden görüntülerin üretilmesine izin verir ve bunu örnekteki metabolitlerin mekansal dağılımını korurkenyapar 9. MALDI'nin antikor etiketlemesi, yapısal değişiklikler veya immünostainingde kullanılanlar gibi diğer özel reaktifler kullanmadan bir numunedeki analizleri tespit etme yeteneği, tek bir deneyde yüzlerce molekülü izleme yeteneği ile birleştiğinde, metabolik profilleme söz konusu olduğunda MS görüntülemenin sağladığı avantajlardan sadece birkaçını içerir10, 11. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve 9-aminoasridin (9-AA) gibi yaygın olarak kullanılan matrise ek olarak, yakın zamanda keşfedilen yeni matris N -(1-Naftalin) Etilenediamine Dihidrochloride (NEDC), çeşitli düşük moleküler ağırlık metabolitlerinin analizleri için çok uygundur, metabolik profil oluşturmada MALDI MSI uygulamasını daha da geliştirmiştir12.
MALDI MSI'ın geniş uygulamasına rağmen, cihazın yüksek maliyeti ve deneysel prosedürün karmaşıklığı, bireysel araştırma laboratuvarlarında daha geniş bir şekilde uygulanmasını engellemektadır. Bu nedenle, MALDI MSI çalışmalarının çoğu ortak temel tesisler aracılığıyla desteklenmektedir. Slayt hazırlama ve matris kaplama dahil olmak üzere numune hazırlama, MALDI MSI'daki en kritik adımdır. Bununla birlikte, slayt hazırlığı normalde bireysel araştırmacının laboratuvarında gerçekleştirilir ve bu da daha sonra MALDI MSI alımında potansiyel varyasyonlar yaratır. Burada, MALDI MSI ölçümlerine geçmeden önce biyolojik örneklerin numune hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamayı ve örnek olarak gelişimsel fare beyninin metabolomik profillemeyi kullanmayı hedefliyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

Deneysel bir örneklemde bulunan küçük molekülleri ve metabolitleri tanımlama ve ölçme çalışması olan metabolomik, gelişim ve hastalıklar sırasında biyolojik faaliyetleri araştırmak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Metabolomics yaklaşımları kanser, beslenme/diyet, diyabet ve metabolik süreçleri içeren diğer fizyolojik ve patolojik durumların incelenmesinde yaygın olarak bunların içinde dirilmektedir. Bu makalede savunulan metabolomik profillemede yardımcı olan avantajlı bir araç matris destekli lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi görüntülemesidir (MALDI MSI). Metabolitleri etiketlemeden, yapısal değişiklikler yapmadan veya immünostainingde kullanılanlar gibi diğer özel reaktifleri yerinde tespit etme yeteneği, MALDI MSI'ı metabolomik alanda ilgili metodolojileri ilerletmede benzersiz bir araç haline getirir. Uygun bir numune hazırlama işlemi en iyi sonuçları vermek için kritik öneme sahiptir ve bu makalenin odak noktası olacaktır.

Temsili deney Şekil 1'degösterilen iş akışına göre gerçekleştirildi. Doğum sonrası 1, 21, 60 (yetişkin) doğum sonrası C57BL wildtype fare beyinleri CUNY IACUC yönergelerine uyarak yukarıda açıklandığı gibi hasat edildi ve sıvı nitrojen üzerinde yüzen bir alüminyum teknede sırasıyla 2, 5 ve 7 dakika donduruldu. Donmuş dokular hem numune kafası hem de oda için −15 °C'de 10 μm kalınlığında bölümlere kriyoseksiyon yapıldı. Doku kriyoseksiyonları daha sonra MALDI görüntüleme için ITO kaplı cam slaytların önceden soğutulmuş iletken tarafına hafifçe aktarıldı. ITO slaytlarına monte edilen kriyoseksiyonlar, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakumda kurutüldü ve ardından otomatik matris püskürtücü kullanılarak matris birikimi yapıldı. Matrix NEDC metabolitleri tespit etmek için kullanıldı ve metanol/suda (70/30, v/v) 10 mg/mL'lik bir matris çözeltisi 0.1 mL/dk akış hızında ve her döngü arasında 5 s kurutma ile 12 döngü için 75 °C nozul sıcaklığında birikti. 1300 mm/dk püskürtme hızı, 2 mm palet aralığı, 10 psi N2 gaz basıncı ve 3 L/dk debi ve 40 mm nozul yüksekliği kullanılmıştır.
MALDI kütle spektrası, MALDI uçuş süresi (TOF) MSI cihazı ile negatif iyon modunda elde edildi. Metanoldeki 0,5-1 μL kırmızı fosfor (n = 1 - 90 ile Pn kümeleri) emülsiyonu, monte edilen dokuların yanındaki ITO slaytlarına biriktirildi ve ikinci dereceden kalibrasyon eğrisi13uygulanarak cihazı 100 - 1000 m/z kütle aralığında kalibre etmek için kullanıldı. Lazer nokta çapları 50 μm raster genişliği için "Orta" modüle ışın profiline odaklanmıştır. M/z 50 ile 1000 arasında kütle aralığındaki spektra, 500 çekim için 1000 Hz'de elde edildi. Kütle spektra verileri kaydedildi ve görüntüleme gelişmiş MALDI MSI veri analiz yazılımı kullanılarak daha da analiz edildi. İyon görüntüleri, kök-ortalama kare (RMS) normalleştirmesi ile ±0,25 Da'lık bir depo gözü genişliğinde oluşturulmuştır.
Şekil 2'deki sonuçlar, her 100 Dalton aralığından seçilen m/z spektrumunun MALDI MSI veri analiz yazılımından çıktı görüntülerini gösterir ve küçük molekül metabolitlerinden yüksek moleküler ağırlıklı lipitlere kadar spektrumların tanımlanması için yardımcı programı açıkça göstermektedir. Her satır, doğum sonrası 1, 21 ve 60. Her temsilci m/z için, bölgesel dağılım ve iyon bolluklarının analizi, farklı yaşlar arasındaki karşılık gelen türlerin göreceli miktarlarını karşılaştırmak için kullanılabilir. MALDI MSI metodolojisinin bir gücü, m/z tarafından tanımlanan belirli türlerin gelişimsel kilometre taşlarına veya belirli anatomik yapılara özgüllüğünü ayırt etme yeteneğidir. Bazı metabolitlerin P1 yenidoğanlarında (m/z 320.1), P60 yetişkinlerde (m/z 846.5) zenginleştirilmiş veya yaşlara eşit olarak dağıtıldığı gözlenir (m/z 480.3); diğer moleküler türler özellikle gri madde (m/z 117.1; 524.3; 765.1), beyaz madde (m/z 673.4; 846.5) veya CSF/ventriküller (m/z 239.0)(Şekil 2A)ile zenginleştirilmiştir. Hipoksantin (m/z 135.0), N-Asetil-L-aspartik asit (m/z 174.0), Araşidonik asit dahil olmak üzere temsili metabolitlerin mekansal dağılımı (m/z 303.2) ve lizosfatidilenthanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE gibi çeşitli lipitler (20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidylethanolamine PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidylinositol PI(38:4) (m/z 885.6) da gösterilmiştir (Şekil 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Şekil 1. MALDI uçuş zamanı (TOF) kütle spektrometresi görüntüleme iş akışı. Çıtçıtlı donmuş doku kriyostat içinde kriyozctioned ve ITO slayt monte edilir. → Doku bölümleri içeren slayt, otomatik matris püskürtücü kullanılarak ince bir matris tabakası ile kaplanmıştır. → Kütle spektrumları MALDI-TOF MSI enstrümanı tarafından 20-200um rasterinde toplanır. → Veriler analiz edilir ve görüntüler gelişmiş MALDI MSI veri analizi yazılımı kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubuğu: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Şekil 2. 50 μm yanal çözünürlükte elde edilen kütle spektrometresinden seçilen m/z spektrumlu temsili çıkış. (A) Isı haritası, P1, P21 ve P60'ta tanımlanan üç gelişimsel kilometre taşı boyunca her 100 Dalton m/z aralığından seçilen belirli metabolit türlerinin mekansal dağılımını gösterir. (B) P1, P21 ve P60'taki temsili metabolitlerin mekansal dağılımı: hipoksantin, N-Asetil-L-aspartik asit, Araşidonik asit ve lizosfatidylethanolamine (LPE), fosfatidylethanolamine (PE), Fosfatidylinositol (PI) gibi farklı lipit türleri. Ölçek çubuğu, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K Görüntüleme.  The City University of New York. Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır. 

Video: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Kök Nodüller

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...