Ye He et Rinat Abzalimov sont soutenus par le Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY) Research Award Program. Yuki Chen et Kelly Veerasammy sont soutenues par le programme de recherche d’été de premier cycle CUNY de la Fondation Alfred P. Sloan.

Le protocole suit les directives du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre de recherche scientifique avancée de la City University of New York (CUNY).
1. Récoltez le tissu
<ol><li>Préparez le bateau en aluminium. Préparez un rectangle en aluminium de 10 cm x 20 cm, pliez au milieu pour faire 10 cm de carré double couche. Étiquetez les informations de l’échantillon d’un côté et pliez l’autre côté pour former un bateau avec une surface inférieure d’environ 4 cm x 4 cm.</li>
	<li>Prérefroidir le bateau sur l’azote liquide (LN2)dans une boîte en polystyrène. REMARQUE: Si le bateau est trop petit, l’échantillon peut tomber du bateau et se figer en contactant directement LN2, ce qui peut entraîner une fragmentation pendant la cryosection.</li>
	<li>Euthanasier l’animal par luxation cervicale en suivant les directives institutionnelles de l’IACUC, disséquer immédiatement le tissu d’intérêt.<ol>
<li>Gardez l’intervalle entre l’anesthésie animale et la congélation instantanée aussi court que possible, afin de minimiser l’altération des métabolites pendant la récolte des tissus, en particulier les métabolites labiaux dans le cerveau en raison de l’ischémie post-mortem. REMARQUE: La perfusion de l’animal avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) augmentera la durée de l’ischémie, modifiant davantage les concentrations de métabolites labiles et exagérant les résultats artéfactuels. Par conséquent, la perfusion ou le lavage des tissus avec du PBS n’est pas recommandé, sauf si la contamination du sang ou des fluides corporels est plus importante que la détérioration des métabolites ou le lavage pour un projet individuel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez immédiatement le tissu dans le bateau en aluminium flottant sur de l’azote liquide, fermez le couvercle de la boîte en polystyrène et congelez pendant 2 à 10 minutes en fonction de la taille du tissu: 2 min, 5 min, 7 min pour le jour postnatal 1 (P1), P21, P60 cerveau de souris, respectivement, et 10 min pour le cerveau de rat P60. REMARQUE: Ne congelez pas le tissu pendant une période prolongée (par exemple, 5 minutes pour le cerveau de souris P1), car le surgelé pourrait entraîner une fragmentation des tissus pendant la cryosection.</li>
	<li>Retirez le bateau à l’érêque, pliez le papier d’aluminium pour envelopper le tissu, transportez-le sur de la glace carbonique et conservez-le à -80 °C pour une utilisation ultérieure. S’il est suivi d’une section immédiate, transporter les échantillons sur de la glace carbonique jusqu’au cryostat. REMARQUE: Pour mieux préserver les métabolites, il est préférable de stocker l’échantillon dans des tissus intacts et de le sectionner juste avant de procéder à l’imagerie MALDI. Le tissu peut être conservé à -80 °C jusqu’à 24 mois.</li>
</ol>2. Cryosection du tissu
REMARQUE: Portez des gants en tout temps lorsque vous manipulez les lames à l’indium-tinoxide (ITO). Évitez de respirer directement sur la glissière ou portez des masques (facultatif) pour éviter la contamination de la salive humaine sur la section des tissus.
<ol><li>Avant de sectionner le tissu, rassemblez le nombre souhaité de lames de verre revêtues d’ITO compatibles MALDI.</li>
	<li>Testez la conductivité de la glissière à l’aide d’un voltmètre réglé sur la résistance. Étiquetez le côté où une mesure de résistance est lue: ce sera le côté auquel les sections de tissu adhèrent. Placez toujours la glissière sur une serviette en papier propre pour éviter toute contamination.</li>
	<li>Pré-refroidir les lames dans un cryostat réglé à -20 °C.</li>
	<li>Si des échantillons de tissus ont été prélevés à -80 °C, laissez le tissu s’équilibrer dans la chambre de cryostat pendant environ 45 à 60 minutes en fonction de la taille du tissu. Si des échantillons sont prélevés de la glace carbonique, équilibrez-les pendant environ 30 minutes.</li>
	<li>Nettoyez soigneusement le cryostat avec 70% d’éthanol. Pré-refroidissez tous les outils nécessaires, y compris le pinceau d’artiste à pointe mince et les pinces dans la chambre de cryostat.</li>
	<li>Régler la température de la chambre de cryostat et de la tête de l’échantillon en fonction du type de tissu: -14 °C pour le foie, -20 °C pour les muscles et -25 °C pour la peau9.</li>
	<li>Montez le tissu sur le mandrin à l’aide d’oct oct d’incorporation de tissu cryogénique, en évitant l’OCT de la région d’intérêt.</li>
	<li>Placez une lame propre dans la scène et verrouillez. Ajustez la position de la scène et l’angle de l’échantillon pour obtenir l’angle de coupe souhaité. REMARQUE: Si différents types / génotypes de tissu doivent être coupés, assurez-vous de repositionner l’échantillon de manière à ce qu’une partie propre de la lame soit utilisée , ou de passer à une nouvelle lame avant de couper l’échantillon suivant pour éviter la contamination croisée.</li>
	<li>Continuez à couper jusqu’à ce que la région d’intérêt (p. ex. le corps calleux dans le cerveau) soit trouvée. Assurez-vous de garder la scène propre en brossant les pièces supplémentaires avec un pinceau d’artiste qui a été équilibré dans le cryostat.</li>
	<li>Une fois que la région souhaitée est révélée, coupez de plus petites sections de 10 à 12 μm d’épaisseur. Si la section a tendance à s’écailler ou à s’effondrer facilement, augmentez la température du cryostat en restant dans la plage de -22 °C à -11 °C. Nous avons constaté que la température de coupe optimale pour le tissu cérébral est de -15 ° C à - 18 ° C.</li>
	<li>Une fois qu’une bonne section a été coupée, collez-la à la glissière ITO (opérez dans la chambre de cryostat).</li>
	<li>Transférez une section du tissu sur des lames ITO à l’aide de la pointe du pinceau d’artiste.</li>
	<li>Réchauffez la section avec les doigts en plaçant un doigt sous la glissière pour réchauffer la section afin d’assurer un montage sûr. La section de tissu deviendra d’abord transparente en 5-10 s, puis deviendra opaque en environ 30-60 s.</li>
	<li>Mettez soigneusement la glissière de côté dans le cryostat.</li>
	<li>Répétez les étapes pour d’autres échantillons de tissus, en vous assurant que chaque section du tissu est placée uniformément sur la lame et est aussi alignée que possible.</li>
	<li>Étant donné que la cible MALDI peut contenir jusqu’à deux diapositives, placez les sections de plusieurs échantillons de la même cohorte sur une seule diapositive ou sur deux lames, pour vous assurer qu’elles peuvent être analysées en même temps.</li>
	<li>Lorsque vous avez terminé, placez les glissières ITO dans une boîte à vide et transférez-les dans un dessiccateur avec un dessiccant. Séchez la lame sous vide pendant 45 à 60 min. REMARQUE: Si un dessiccateur sous vide n’est pas disponible en laboratoire, maintenez les lames sous -20 ° C tout le temps pour éviter la détérioration des métabolites.</li>
	<li>Stockage et expédition des lames : à moins que l’échantillon ne soit préparé par les installations centrales d’imagerie MALDI pour passer directement à l’imagerie MALDI, stocker les lames à -80 °C ou les expédier aux installations centrales ou à d’autres laboratoires de recherche MALDI sur de la glace carbonique.</li>
	<li>Pour préserver au mieux les échantillons, placez les glissières dans le transporteur de diapositives, remplissez-les d’azote (facultatif), scellez-les avec un parafilm, placez-les dans un sac zippé, qui est ensuite placé dans un autre sac zippé contenant du dessiccant. Étiquetez le sac zippé extérieur.</li>
	<li>Procéder à l’entreposage à -80 °C (jusqu’à 6 mois) ou à l’expédition avec de la glace carbonique adéquate.</li>
</ol>3. Préparation de la matrice
<ol><li>Préparez la matrice. REMARQUE: Tous les réactifs doivent être de qualité HPLC.<ol>
<li>Préparer le NEDC à une concentration de 10 mg/mL. Préparer 10 mL de matrice dissoute dans un solvant de méthanol à 70 % (100 mg de NEDC, 7 mL de méthanol, 3 mL deH2O).</li>
		<li>En outre, préparez une solution supplémentaire de 10 mL de méthanol:eau à 70% pour rincer le système de pulvérisation avant de remplir la matrice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois les lames déshydratées à l’étape 2.17, placez des marques « X » sur l’espace vide de la lame de verre à l’extérieur des sections de tissu à l’aide d’un marqueur argenté à pointe audacieuse, puis placez un deuxième « x » avec un marqueur noir à point fin sur le « X » argenté. Le « X » noir avec un contraste net sur le fond argenté (le « X » argenté gras) servira plus tard de marqueur fiduciaire pour l’acquisition ultérieure de spectres de masse dans l’instrument MALDI.</li>
	<li>Chargez la glissière dans la cible métallique de la glissière MALDI. Utilisez un couvercle en plastique et dessinez/dessinez/contourez l’endroit où se trouvent les échantillons sur le couvercle en plastique. Réserver.</li>
	<li>Numérisez l’image de la diapositive avec la cible MALDI à l’aide d’un scanner à plat. Les vis à la surface de la cible serviront d’espacement pour éviter l’endommagement ou la contamination de la section tissulaire par le scanner. Prévisualisez et analysez la zone de diapositive sélectionnée en niveaux de gris 16 bits et 2400 ppp. Enregistrez l’image pour une utilisation ultérieure dans MALDI MSI.</li>
</ol>4. Dépôt matriciel
REMARQUE: Il existe plusieurs méthodes pour appliquer une couche uniforme de matrice de taille cristalline fine sur la lame MALDI, y compris la sublimation, l’impression jet d’encre par gouttelettes, le pulvérisateur automatique de matrice et la pulvérisation manuelle à l’aide de l’artiste airbush9. Nous utiliserons le pulvérisateur à matrice automatique comme exemple dans ce protocole pour sa haute reproductibilité.
<ol><li>Démarrage : Allumez l’unité de pulvérisation matricielle, en vous assurant que la vanne est positionnée à LOAD et lancez le logiciel de pulvérisation. Vérifiez que le ventilateur d’extraction fonctionne bien. Ne démarrez pas la pompe à solvant si la ventilation active ne fonctionne pas correctement.</li>
	<li>Vérifiez dans l’onglet Comms que tout communique, puis démarrez la pompe à solvant à 0,1 mL/min, avec une contre-pression d’environ 500 psi (ou 3,4 MPa).</li>
	<li>Démarrez le flux d’air comprimé vers le pulvérisateur matriciel en réglant le réservoir d’azote sur 30 psi. Ensuite, réglez le régulateur de pression à l’avant du pulvérisateur à 10 psi et réglez la température de la buse du pulvérisateur comme vous le souhaitez. REMARQUE: Si la pression de l’air dans la prière est inférieure à 5 psi, la buse du pulvérisateur ne pourra pas chauffer pour se protéger.</li>
	<li>Avec la valve toujours en position LOAD, utilisez une seringue pour rincer la boucle avec 7 mL de méthanol à 70%, puis remplissez la boucle avec 6 mL de matrice.</li>
	<li>Placez les tissus glissés dans les supports du pulvérisateur, en scotchant les deux extrémités pour empêcher tout mouvement et pour préserver un bord sans matrice afin d’éviter la contamination de la pince métallique sur la cible MALDI par la matrice. REMARQUE: Il est fortement recommandé de tester d’abord la pulvérisation matricielle sur une lame de microscope vierge avant de procéder à de précieuses lames d’échantillon.</li>
	<li>Vérifiez que le débit et la température sont stables pour commencer la pulvérisation.</li>
	<li>Sélectionnez la méthode souhaitée pré-testée à l’aide d’une lame en verre vierge.</li>
	<li>Appuyez sur Démarrer. Cela réglera la température de la buse et ajustera le débit de la pompe pour qu’il corresponde à la méthode sélectionnée. Basculez la vanne de la position Charge à la position Pulvérisation, puis confirmez en cliquant sur Continuer.</li>
	<li>Laissez le système fonctionner, ce qui prendra 5 à 20 minutes par diapositive selon la méthode. Basculez la vanne de la position De pulvérisation à la position de chargement, puis confirmez en cliquant sur Continuer lorsque vous avez terminé.</li>
	<li>Retirez la ou les lames du pulvérisateur, examinez le motif du revêtement matriciel au microscope pour assurer une couche uniforme de cristal à matrice fine.</li>
	<li>Après le dépôt de la matrice, placez la ou les lames dans le support MALDI métallique pour une utilisation immédiate. S’il n’y a qu’une seule diapositive d’échantillon, ajoutez une autre diapositive vierge pour remplir les deux espaces du support MALDI.</li>
	<li>Nettoyez le système immédiatement après l’utilisation en suivant les instructions du fabricant, afin d’éviter le colmatage de la buse du pulvérisateur.</li>
	<li>Une fois que la lame d’échantillon est recouverte de matrice, passez immédiatement à l’instrument d’imagerie MALDI ou expédiez-la avec de la glace carbonique en utilisant la même préparation de sac à double fermeture à glissière décrite à l’étape 2.19. REMARQUE: Dans des circonstances d’urgence telles que l’instrument MALDI n’est pas disponible pour une utilisation immédiate, stocker la lame revêtue sous vide ou à -20 ° C pendant 24 heures, bien que la détérioration de certains métabolites puisse se produire pendant le stockage, ce qui n’a pas été soigneusement étudié.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Watkins, S. M., German, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+biochemical+profiling+in+drug+discovery+and+development.">Metabolomics and biochemical profiling in drug discovery and development.</a> Current Opinion in Molecular Therapeutics. 4, 224-228 (2002).</li><li>Fernie, A. R., Trethewey, R. N., Krotzky, A. J., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling:+from+diagnostics+to+systems+biology.">Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 763-769 (2004).</li><li>Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J., Wilson, I. 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J., Snel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+MALDI+MS+imaging:+Current+technologies+and+future+challenges.">Small molecule MALDI MS imaging: Current technologies and future challenges.</a> Methods. 104, 127-141 (2016).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) est une technique d’imagerie sans étiquette qui permet aux chercheurs d’étudier la distribution de diverses biomolécules et leurs modifications dans les tissus, base moléculaire de la pathologie. L’utilisation combinée de MALDI-MSI avec les approches LC-MS traditionnelles pour l’analyse tissulaire fournit la même profondeur moléculaire que les flux de travail Omics traditionnels, mais qui conserve également la relation spatiale de ces signaux au sein du réseau cellulaire. La préparation de l’échantillon est l’étape la plus critique de MALDI MSI et tient compte de la variation des lectures finales des études métabolomiques réalisées dans différents laboratoires4. Nous fournissons ici un protocole complet mais pratique pour normaliser la préparation des échantillons pour le profilage métabolomique à l’aide de MALDI MSI, dans l’espoir qu’il sera bénéfique pour une large communauté de recherche de mettre en œuvre MALDI MSI dans leurs recherches actuelles et futures, de la biologie fondamentale aux études translationnelles.
Il faut toujours garder à l’esprit toutes les précautions pour minimiser les changements dans les profils moléculaires (à la fois les abondances et la distribution spatiale) lors de la préparation des échantillons et éviter la contamination. Tout d’abord, minimiser le temps entre l’euthanasie animale et la récolte des tissus, tels que congelés in situ ou chauffés par fixation par micro-ondes pour inactiver les enzymes dans le cerveau afin de réduire la responsabilité de l’ischémie post-mortem4,5,6. Deuxièmement, l’état de congélation instantanée de l’échantillon est critique. Une congélation inadéquate entraînera la dégradation et la perte des métabolites, tandis qu’une congélation excessive entraînera une fragmentation des tissus pendant la cryosection. Le temps de congélation doit toujours être testé en premier selon les études précédentes rapportées, et l’étude du cerveau de souris développementale présentée dans cet article fournit les points de référence pour le tissu cérébral des rongeurs. Troisièmement, la découpe de tissus biologiques et le transfert de leurs sections sur les lames de l’UIT nécessiteront une pratique adéquate. Il est important de noter que lors de l’utilisation du pinceau pour ramasser la section de la scène, le pinceau doit être utilisé délicatement. Laissez les poils de la brosse n’entrer en contact qu’avec les bords de la section de tissu afin de réduire le risque de contamination et de fragmentation de la section. Aplatissez la section sur la diapositive autant que possible, cela empêchera le curling de la section pendant le réchauffement des doigts. Quatrièmement, lors du montage sur la glissière ITO, assurez-vous que toute la section est bien attachée à la lame ITO, car différentes régions du tissu peuvent nécessiter un temps différent de réchauffement des doigts. Par exemple, le tissu tumoral cérébral nécessite un temps de réchauffement plus long que le tissu cérébral normal. Un mauvais montage peut entraîner un détachement et une fragmentation du tissu pendant le balayage MALDI-MS. Gardez à l’esprit que le réchauffement des doigts pourrait permettre l’action enzymatique et le métabolisme provoquant des changements artéfactuels des métabolites. Cinquièmement, un dépôt fin et uniforme de la matrice MALDI joue un rôle important dans l’obtention d’informations spatiales précises et d’un signal MALDI-MS fort. Il est recommandé de tester la pulvérisation matricielle sur une lame vierge et d’observer le motif cristallin au microscope pour vérifier la bonne couverture, avant de procéder au revêtement de la précieuse lame d’échantillon. Et enfin, étant donné qu’un chercheur individuel exécute le prélèvement de tissus et la préparation des lames à des vitesses différentes, il serait idéal d’avoir une personne pour gérer la préparation de l’échantillon pour l’échantillon dans la même cohorte, afin de minimiser la variation.
Le protocole fourni ci-dessus détaille les procédures standard, qui peuvent être adaptées aux besoins d’expériences particulières. Par exemple, un gel de cryo-sectionnement OCT, qui est normalement utilisé dans la cryo-section de l’échantillon, peut être utilisé comme colle de montage sur le mandrin de tissu (comme dans l’étude décrite ci-dessus). Des études antérieures ont montré que le composant polymère dans l’OCT provoque une forte suppression desions 14. Cependant, l’incorporation de l’échantillon peut être inévitable dans les cas où le tissu est trop fragile pour être coupé sans support supplémentaire d’un gel polymère. Afin de lutter contre la suppression du signal dans ces cas, les tissus peuvent avoir besoin d’être lavés avec un lavage en série à 70% d’éthanol et à 95% d’éthanol pour éliminer les OCT résiduels pour la détection de protéines ou de lipides, tandis que le lavage n’est pas recommandé pour la détection de petits métabolites moléculaires9.
MALDI MSI est devenu de plus en plus pertinent dans le laboratoire de recherche et la pratique clinique. Par exemple, MALDI MSI s’est récemment avéré utile dans les études de protéomique afin de caractériser l’état fonctionnel phénotypique d’un organisme15, et en agissant comme agent pour l’identification microbienne et le diagnostic de la maladie ultérieure16. Bien que MALDI MSI prenne en charge un large éventail d’applications, il existe certaines limites associées au fait de s’appuyer uniquement sur cette technique, en particulier lorsqu’il s’agit de différencier des espèces ou des métabolites similaires et d’identifier des cibles spécifiques. Un autre défi est la quantification de la concentration de métabolites selon les signaux MALDI MSI. On suppose souvent que les abondances d’ions dans les spectres MALDI MSI et la distribution spatiale (ou les abondances relatives) des espèces moléculaires correspondantes à travers les tissus disséqués sont bien corrélées. Cependant, il faut toujours garder à l’esprit que la relation entre l’intensité ionique et la quantité d’espèces moléculaires correspondantes est compliquée par de nombreux facteurs, y compris, mais sans s’y limiter, les effets de la suppression des ions, les changements dans la structure tissulaire et les réactions ion-molécule17. Des techniques utilisant des étalons internes peuvent être mises en œuvre pour la quantification absolue (tissu μmol/g) dans MALDI-MSI18. Ces deux défis sont généralement abordés avec le flux de travail combiné de MALDI MSI avec les techniques de chromatographie liquide en tandem MS (LC-MS / MS), par lesquelles MALDI-MS permet la cartographie de la région d’intérêt, qui est ensuite soumise à une microextraction et LC-MS / MS pour fournir plus d’informations pour identifier le métabolite19.
Des méthodes d’imagerie basées sur la SEP ont été développées ces dernières années en tant que modalité alternative aux techniques précédentes d’imagerie des métabolites de petites molécules. Avec les progrès et la popularité croissante de MALDI MSI, on s’attend à ce que l’imagerie MALDI devienne un nouvel outil standard pour visualiser de petites molécules. L’imagerie de petites molécules lipidiques et endogènes (par exemple les neurotransmetteurs et les métabolites) dans le contexte biologique, ainsi que l’imagerie des xénobiotiques pour le développement de nouveaux agents pharmaceutiques sont particulièrement intéressantes. Ces trois domaines devraient connaître des progrès rapides avec l’application de MALDI MSI dans un proche avenir20.

Les métabolites, les intermédiaires ou les produits finaux du métabolisme, y compris les nucléotides, les acides aminés ou organiques, les lipides, sont des composants clés des fonctions et des processus biologiques. La métabolomique, l’étude des métabolites, permet d’explorer leurs interactions biochimiques et de comprendre leurs rôles dans le contexte de la recherche fondamentale, translationnelle et clinique. Les métabolites sont fortement associés aux phénotypes des organismes et fournissent des informations sur les activités biochimiques qui se produisent au cours du métabolisme cellulaire1. Par conséquent, en plus de la génomique et de la protéomique, la métabolomique est devenue un outil important pour comprendre les conditions physiologiques et pathologiques. Par exemple, la métabolomique est utilisée pour élucider les mécanismes derrière les médicaments existants ainsi que leur tolérance. Dans le développement de médicaments, le métabolisme xénobiotique est utile pour évaluer l’activité ou la toxicité des métabolites d’une espèce à l’autre, ce qui se traduit plus tard par un soutien à la médecine personnalisée2. Malgré la large application de la métabolomique, l’imagerie des métabolites peut être difficile en raison de la réactivité chimique des métabolites, de leur hétérogénéité structurelle et de leur large plage de concentration3. Cependant, les concentrations de métabolites labiles, y compris les composés à haute énergie, le glucose, le lactate, le glycolytique, la voie de dérivation du pentose et les intermédiaires du cycle TCA, les phospholipides, les neurotransmetteurs, les composés de signalisation, peuvent changer en quelques secondes et progresser en quelques minutes lorsque les enzymes tissulaires sont actives pendant les procédures de prélèvement tissulaire, telles que l’ischémie post-mortem dans la récolte du cerveau4,5,6 . Pour assurer une acquisition précise des données métabolomiques, une préparation appropriée et minutieuse des échantillons est essentielle7,8. Les plates-formes actuellement établies pour mesurer les métabolites comprennent la RMN, les essais enzymatiques et la spectrométrie de masse (y compris la chromatographie liquide et gazeuse), dont la dernière est discutée plus en détail ci-dessous.
MALDI-MSI est une technique de pointe qui permet l’analyse d’échantillons complexes grâce à la détection d’espèces moléculaires individuelles. MALDI MSI offre l’avantage de pouvoir mesurer rapidement et de manière reproductible divers composés moléculaires dans des échantillons biologiques. L’imagerie par spectrométrie de masse permet en outre la production d’images qui représentent la biologie tissulaire basée sur ses métabolites composites, tout en préservant la distribution spatiale des métabolites dans l’échantillon9. La capacité de MALDI à détecter des analytes dans un échantillon sans l’utilisation de marquage d’anticorps, de modifications structurelles ou d’autres réactifs spécialisés, tels que ceux utilisés dans l’immunocoloration, associée à sa capacité à surveiller des centaines de molécules au sein d’une seule expérience ne comprend que quelques-uns des avantages accordés par l’imagerie MS en matière de profilage métabolique10, 11. En plus de la matrice couramment utilisée telle que l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) et la 9-aminoacridine (9-AA), récemment découverte d’une nouvelle matrice N-(1-Naphtyl) Dichlorhydrate d’éthylènediamine (NEDC), qui convient bien à l’analyse de divers métabolites de faible poids moléculaire, a encore amélioré l’application de MALDI MSI dans le profilage métabolique12.
Malgré la large application de MALDI MSI, le coût élevé de l’instrument et la complexité de la procédure expérimentale empêchent sa mise en œuvre plus large dans les laboratoires de recherche individuels. Par conséquent, la plupart des études MALDI MSI sont soutenues par des installations de base partagées. La préparation de l’échantillon, y compris la préparation des lames et le revêtement matriciel, est l’étape la plus critique de MALDI MSI. Cependant, la préparation des lames est normalement effectuée dans le laboratoire de chaque chercheur, ce qui crée des variations potentielles dans l’acquisition ultérieure de MALDI MSI. Ici, nous visons à fournir un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons biologiques avant de procéder aux mesures MALDI MSI, et utilisons un profilage métabolomique du cerveau de souris développementale comme exemple.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>222488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for metabolic profiling using maldi mass spectrometry imaging

La métabolomique, l’étude visant à identifier et à quantifier les petites molécules et les métabolites présents dans un échantillon expérimental, est devenue un outil important pour étudier les activités biologiques au cours du développement et des maladies. Les approches métabolomiques sont largement utilisées dans l’étude du cancer, de la nutrition / alimentation, du diabète et d’autres conditions physiologiques et pathologiques impliquant des processus métaboliques. Un outil avantageux qui aide au profilage métabolomique préconisé dans cet article est l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI). Sa capacité à détecter les métabolites in situ sans étiquetage, modifications structurelles ou autres réactifs spécialisés, tels que ceux utilisés dans l’immunocoloration, fait de MALDI MSI un outil unique pour faire progresser les méthodologies pertinentes dans le domaine de la métabolomique. Un processus approprié de préparation des échantillons est essentiel pour obtenir des résultats optimaux et sera au centre de cet article.

L’expérience représentative a été réalisée selon le flux de travail illustré à la figure 1. Les cerveaux de souris de type sauvage C57BL de développement des jours postnatals 1, 21, 60 (adulte) ont été récoltés comme décrit ci-dessus en suivant les directives CUNY IACUC et ont été congelés pendant 2, 5 et 7 minutes, respectivement, sur un bateau en aluminium flottant sur de l’azote liquide. Les tissus congelés ont été cryosectionnés à des sections de 10 μm d’épaisseur à −15 °C fixées à la fois pour la tête de l’échantillon et la chambre. Les cryosections tissulaires ont ensuite été doucement transférées sur le côté conducteur pré-refroidi des lames de verre revêtues d’ITO pour l’imagerie MALDI. Les cryosections montées sur des lames ITO ont été desséchées sous vide pendant 45 minutes à température ambiante, suivies d’un dépôt matriciel à l’aide d’un pulvérisateur automatique. Matrix NEDC a été utilisé pour détecter les métabolites, et une solution matricielle de 10 mg/mL dans du méthanol/eau (70/30, v/v) a été déposée à un débit de 0,1 mL/min et à une température de buse de 75 °C pendant 12 cycles avec un séchage de 5 s entre chaque cycle. Une vitesse de pulvérisation de 1300 mm/min, un espacement des voies de 2 mm, une pression de gazN2 de 10 psi et un débit de 3 L/min et une hauteur de buse de 40 mm ont été utilisés.
Les spectres de masse MALDI ont été acquis en mode ion négatif par l’instrument MSI à temps de vol MALDI (TOF). 0,5-1 μL d’émulsion de phosphore rouge (grappes de Pn avec n = 1 - 90) dans le méthanol a été déposé sur les lames ITO, à côté des tissus montés, et utilisé pour calibrer l’instrument dans la gamme de masse 100 - 1000 m/z en appliquant la courbe d’étalonnage quadratique13. Les diamètres des points laser ont été focalis sur un profil de faisceau modulé « Medium » pour une largeur raster de 50 μm. Des spectres dans la plage de masse de m/z 50 à 1000 ont été acquis à 1000 Hz pour 500 prises de vue. Les données du spectre de masse ont été enregistrées et l’imagerie a été analysée plus en détail à l’aide du logiciel avancé d’analyse de données MALDI MSI. Les images ioniques ont été générées avec une normalisation rmS (root-mean square) à une largeur de bac de ±0,25 Da.
Les résultats de la figure 2 montrent des images de sortie du logiciel d’analyse de données MALDI MSI de spectres m/z sélectionnés dans tous les intervalles de 100 Dalton, illustrant clairement l’utilité pour l’identification des spectres des métabolites de petites molécules aux lipides de poids moléculaire élevé. Chaque rangée représente des cartes thermiques ioniques respectives contenant des informations spatiales et spectrales d’une certaine espèce de métabolite sur trois tissus collectés aux jours postnatals 1, 21 et 60. Pour chaque m/z représentatif, l’analyse de la répartition régionale et de l’abondance des ions peut être utilisée pour comparer les quantités relatives d’espèces correspondantes entre différents âges. L’une des forces de la méthodologie MALDI MSI est la capacité de discerner la spécificité de certaines espèces identifiées par m/z à des jalons de développement ou à des structures anatomiques spécifiques. On observe que certains métabolites sont enrichis chez les nouveau-nés P1 (m/z 320,1), enrichis chez les adultes P60 (m/z 846,5) ou uniformément répartis entre les âges (m/z 480,3); d’autres espèces moléculaires sont spécifiquement enrichies en matière grise (m/z 117,1; 524,3; 765,1), en substance blanche (m/z 673,4; 846,5) ou en LCR/ventricules (m/z 239,0)(figure 2A). La distribution spatiale des métabolites représentatifs, y compris l’hypoxanthine (m/z 135,0), l’acide N-acétyl-L-aspartique (m/z 174,0), l’acide arachidonique (m/z 303,2) et plusieurs lipides tels que la lysophosphatidyléthanolamine LPE (18:1) (m/z 478,3), le LPE(20:4) (m/z 500,3), le LPE (22:6) (m/z 524,3), la phosphatidyléthanolamine PE (44:10) (m/z 838,5), le phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885,6) sont également représentés (Figure 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig01.jpg"> Graphique 1. Flux de travail de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI-temps de vol (TOF). Le tissu congelé est cryrosectionné dans du cryostat et monté sur une lame ITO. → La lame avec des sections de tissu est recouverte d’une fine couche de matrice à l’aide d’un pulvérisateur à matrice automatique. → spectres de masse est collecté par l’instrument MALDI-TOF MSI à un raster de 20-200um. → Les données sont analysées et les images sont générées à l’aide du logiciel avancé d’analyse de données MALDI MSI. Barre d’échelle: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2.jpg"> Graphique 2. Sortie représentative avec des spectres m/z sélectionnés de spectrométrie de masse acquis à une résolution latérale de 50 μm. (A) Une carte thermique illustre la distribution spatiale d’espèces de métabolites spécifiques sélectionnées dans chaque intervalle de 100 Dalton m/z à travers les trois étapes de développement identifiées à P1, P21 et P60. (B) La distribution spatiale des métabolites représentatifs à P1, P21 et P60, y compris: l’hypoxanthine, l’acide N-acétyl-L-aspartique, l’acide arachidonique et différentes espèces lipidiques telles que la lysophosphatidyléthanolamine (LPE), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylinositol (PI). Barre d’échelle, 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62008/62008fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation des échantillons lors de la planification d’expériences utilisant MALDI MSI pour maximiser la détection métabolique et moléculaire dans les échantillons biologiques.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

sample-preparation-for-metabolic-profiling-using-maldi-mass

Research

JoVE Journal

Biology

5.9K vues.  The City University of New York. L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation des échantillons lors de la planification d’expériences utilisant MALDI MSI pour maximiser la détection métabolique et moléculaire dans les échantillons biologiques. 

Vidéo: Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse &amp; MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...