Das Turner-Syndrom ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurokognitive Defekte. In einigen Fällen verursacht es den Tod des Fötus.
Obwohl somatische Zellen von aneuploiden Föten biologisch wertvoll sind, sind sie kurzlebig, was ihre Verwendung in der Forschung einschränkt. Die Erzeugung von iPSC ist somit eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur dauerhaften Erhaltung der aneuploiden Merkmale. Sie sind selbsterneuernd und können sich in spezialisierte Zelltypen differenzieren, die an die frühe Embryonalentwicklung erinnern.
Die Verabreichung von nicht-integrierenden episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Kernfiktion ist eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Erzeugung vollständig reprogrammierter und stabiler iPSCs. Diese Methode kann auch auf Zellen angewendet werden, die schwer zu programmieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir die Regeneration von iPS-Zellen aus fetalem Material mit Aneupliod.
Die gesammelten fetalen Chorionzotten in eine sterile Petrischale geben. Waschen Sie es mehrmals mit PBS, das 1X antibiotische antimykotische Lösung enthält. Entfernen Sie das PBS vollständig durch Pipettieren.
1 ml Kollagenasemischung in die Zotten geben und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren oder bis das Gewebe zerfällt. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die Kollagenase durch Zugabe von Medien, die 10% fötales Rinderserum enthalten. Den Inhalt der Petrischale in ein 15-ml-Röhrchen geben.
Zentrifugieren Sie den Digest, um die zerfallenen Zotten und freigesetzten Zellen zu sammeln. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig. Plattenzerstörte Zotten zusammen mit freigesetzten Zellen in einem T25-Kulturkolben und AmnioMAX-Medien und wachsen, bis eine konfluente Fibroblastenkultur erhalten wird.
Erweitern Sie Fibroblasten und Kultur, um Bestände für die Verwendung in nachfolgenden Transfektions- und Charakterisierungsexperimenten vorzubereiten. Bereiten Sie Alkalikulturen vor, die die reprogrammierenden Plasmide enthalten. Isolieren Sie die Plasmide mit Midi-Plasmid-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Suspendieren Sie jede Palette in einem geeigneten Volumen von DNAse RNAse freiem Wasser, um eine Endkonzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Überprüfen Sie die Plasmide mit dem ECoR1 Restriction Digestion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Trypsinisieren Sie die Chorionzotten fibroblasten.
Neutralisieren und zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 5 ml OPTI-MEM erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und entfernen Sie 1 Million Zellen für die Nukleofektion.
Zentrifuge, um die Zellpalette zu erhalten. Führen Sie eine Nukleofektion mit dem Amaxa NHDF Neukleofaktor-Kit durch. Herstellung eines Neukleofaktor-Reagenzes durch Mischen von 0,5 ml Ergänzung und 2,25 ml Nukleofaktorlösung, die im Kit enthalten ist.
Entfernen Sie 100 Mikroliter Nukleofaktorlösung und fügen Sie 1 Mikrogramm jedes Plasmids hinzu. Suspendieren Sie vorsichtig 1 Million Zellen in dieser Mischung. Übertragen Sie die Zell-DNA-Suspension in die Küvette und stellen Sie sicher, dass die Probe den Boden der Küvette ohne Luftblasen bedeckt.
Verschließen Sie die Küvette und stecken Sie sie in die Halterung. Wählen Sie das Nukleofaktorprogramm D-23 für hohe Effizienz und wenden Sie es an. Entfernen Sie die Küvette aus der Halterung und fügen Sie 1 ml AmnioMAX-Medien hinzu.
Geben Sie den Inhalt vorsichtig in eine mit Gewebekultur behandelte Petrischale mit der im Kit enthaltenen Pipette. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Halten Sie die Zellen in AmnioMAX-Medien für 10 Tage und wechseln Sie dann für 20 Tage auf Pluripotenzmedium.
Für die iPSC-Expansion sezieren Sie manuell die embryonalen stammzellähnlichen Kolonien, die in der Reprogrammierungsschale mit einer gezogenen Glaspipette gebildet werden. Vermehren Sie iPS-Zellen entsprechend und massieren Sie sie alle fünf bis sieben Tage. Die iPCSs waren positiv auf pluripotenzmarker alkalische Phosphatase.
Erzeugen Sie embryoide Körper, indem Sie die iPSC-Kolonien in kleine Stücke schneiden und sie in Petrischalen mit geringer Bindung im embryoiden Körpermedium plattieren. Die Ektodermdifferenzierung wird induziert, indem am vierten Tag embryoide Körper im Ektoderm-Differenzierungsmedium plattiert werden. In ähnlicher Weise wird die Mesodermdifferenzierung induziert, indem tag acht embryoide Körper im Mesoderm-Differenzierungsmedium plattiert werden.
Zur Induktion der Endodermdifferenzierung werden iPS-Zellen in einer Monoschicht im Endodermdifferenzierungsmedium kultiviert. Morphologische Veränderungen in Fibroblasten wurden im Zuge der Reprogrammierung beobachtet. Sie exprimieren eine epithelzellähnliche Morphologie und bildeten kompakte Kolonien.
Die Zellen hatten auch ein Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma, typisch für pluripotente Zellen in Kultur. Die iPSCs besaßen einen 45 XO-Trägertyp und waren positiv für die Pluripotenzmarker OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 und E-CADHERIN. Die Zellen wurden auf repräsentative Keimschichtmarker angefärbt.
Das Turner-Syndrom entwickelt somit neurokognitive Defizite. Neuronen, die vom Turner-Syndrom iPSC abgeleitet sind, können ein ausgezeichnetes Modell sein. Dies wird in einer Petriplatte modelliert, um die neue Linie des normalen dissoziativen Turner-Syndroms zu verstehen.
