Dieses Protokoll ist nützlich, um genetische Manipulationen an symbiotischen Bakterien durchzuführen, in diesem Fall speziell an Burkholderia, und die Gene zu identifizieren, die für die Besiedlung eines Insektenwirts unerlässlich sind. Die Transposon-Insertionssequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine große Anzahl von bedingt essentiellen Genen gleichzeitig in einem einzigen Experiment zu identifizieren. Beginnen Sie mit der Impfung einer frischen Spenderkultur von E.coli-Spender in 10 Millilitern LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin und DAP unter einer sterilen Haube.
Inokulation Von Burkholderia gladioli Stamm A Empfängerzellen in fünf Milliliter KB Medium. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker bei 250 U / min. Nach dem Wachstum über Nacht zentrifugieren Sie vier Milliliter jeder der Kulturen bei 9.600 mal G für sechs Minuten, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu entsorgen.
Waschen Sie die pelletierten Zellkulturen unter einer sterilen Haube in KB-Medium, das DAP enthält. Und schließlich, resuspendieren Sie die Kulturen separat in vier Milliliter KB plus DAP-Medium. In einem frischen 15-Milliliter-Röhrchen mischen Sie 250 Mikroliter der gewaschenen E.coli-Spenderzellen mit einem Milliliter der gewaschenen Burkholderia gladioli-Empfängerzellen.
Entdecken Sie 10 Mikroliter dieser Konjugationszellmischung auf KB-Agarplatten, die DAP enthalten. Lassen Sie die Platte eine Stunde lang ungestört in der sterilen Haube bei Raumtemperatur ruhen. Inkubieren Sie die Platten mit den Konjugationsflecken bei 30 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden.
Nach der Inkubation zwei bis vier Milliliter 1X PBS unter einer sterilen Haube auf die Platten geben und mit einem Zellschaber die gewachsenen bakteriellen Konjugationsstellen aus dem Agar freisetzen. Dann pipetten Sie die konjugierte Zellmischung in zwei Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 9.600 mal G für zwei Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal in einem Milliliter 1X PBS durch Pipettieren nach oben und unten. Resuspend das endgültige Pellet in 1.200 Mikrolitern 1X PBS. Gut mischen und 100 Mikroliter der Zellmischung auf großen KB-Agarplatten verteilen, die mit Kanamycin ergänzt werden, und über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren.
Zählen Sie die Gesamtzahl der transkonjuganten Kolonien auf den drei Platten und extrapolieren Sie, um die ungefähre Anzahl der Mutanten zu berechnen, die in allen Platten erhalten wurden. Um die Chancen auf eine repräsentative Bibliothek zu erhöhen, stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Kolonien um ein Vielfaches höher ist als die Gesamtzahl der Gene im Genom. Um den Erfolg der Konjugation zu bestätigen, führen Sie eine PCR durch, die auf die Einlegekassette mit 10 bis 20 Probenkolonien abzielt, wie im Manuskript beschrieben.
Unter einer sterilen Kapuze kratzen Sie die Kolonien von den Platten, indem Sie ein bis zwei Milliliter 1X PBS auf das Agar geben. Die von den Platten abgekratzte Zellmischung in 50-Milliliter-Röhrchen einfüllen. Wirbeln Sie die Bibliothek gründlich durch, und teilen Sie dann einen Milliliter der gepoolten Mutantenbibliothek in mehrere Kryoröhren auf.
Einen Milliliter 70% Glycerin in die Röhrchen geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Wählen Sie ein L.villosa-Eiergelege und zählen Sie die Anzahl der Eier, die fortgesetzt werden, wenn das Gelege mehr als 100 Eier enthält. Um das gesamte Eiergelege zu sterilisieren, fügen Sie 200 Mikroliter 70% Ethanol hinzu und waschen Sie die Eier fünf Minuten lang vorsichtig, entfernen Sie dann das Ethanol und waschen Sie die Eier zweimal mit autoklaviertem Wasser.
Fügen Sie 200 Mikroliter 12% Bleichmittel hinzu und waschen Sie die Eier 30 Sekunden lang sanft. Entfernen Sie das Bleichmittel sofort und waschen Sie die Eier dreimal mit 200 Mikrolitern autoklaviertem Wasser. Infizieren Sie die Eier im sterilisierten Eigelege mit zwei Mal 10 bis sechs Zellen pro Mikroliter der gewaschenen Mutantenbibliothek in PBS.
Zwei Tage nach dem Schlüpfen der infizierten Käferlarven 100 Sekunden Instar-Larven pro 1,5 Milliliter Mikrofugenröhrchen sammeln und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die In-vitro-Kontrollbibliothek zu erzeugen, impfen Sie 250 Mikroliter von zweimal 10 zu den sechs Zellen pro Mikroliter der Mutantenbibliothek in 10 Milliliter KB-Medium, das Kanamycin enthält. Nachdem Sie DNA aus den in vivo und in vitro gewachsenen Mutantenbibliotheken extrahiert haben, teilen Sie die DNA mit einem Ultraschallgerät.
Um zu überprüfen, ob die DNA auf den gewünschten Größenbereich geschoren wurde, laden Sie fünf Mikroliter der ungehörten und geschorenen DNA nach dem Mischen mit Gelbeladungsfarbstoff in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis auf einem 1,6% Agarosegellauf bei 250 Volt für 40 Minuten. Um die für die Adapterligatur erforderlichen Fragmentenden vorzubereiten, fügen Sie zunächst drei Mikroliter der Enzymmischung und sieben Mikroliter Reaktionspuffer auf 50 Mikroliter der geschorenen DNA hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Stellen Sie einen Thermocycler mit einem beheizten Deckel auf mehr oder gleich 75 Grad Celsius und inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten bei 20 Grad Celsius und 30 Minuten bei 65 Grad Celsius, dann halten Sie die Temperatur bei vier Grad Celsius.
Für die Adapterligatur fügen Sie 30 Mikroliter Ligationsmastermischung, ein Mikroliter Ligationsverstärker und 2,5 Mikroliter verdünnten Adapter zu den Produkten des Endvorbereitungsschritts hinzu. Durch Pipettieren gründlich mischen und die Probe 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius im Thermocycler mit abgezogenem deckel erhitzen. Nach 15 Minuten drei Mikroliter des Enzyms hinzufügen.
Mischen Sie die Probe gut durch Pipettieren und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler, wobei der Deckel auf mehr als oder gleich 47 Grad Celsius erhitzt wird. Um die Größe der adapterligierten DNA auszuwählen, die auf Fragmente von 250 Basenpaaren abzielt, beginnen Sie mit dem Wirbeln der magnetischen Perlenlösung und legen Sie sie vor Gebrauch 30 Minuten lang auf Raumtemperatur. Fügen Sie 0,3 mal Perlen zu 96,5 Mikrolitern der ligierten DNA-Mischung hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren.
Inkubieren Sie die Perlenmischung für fünf Minuten. Legen Sie die Röhrchen auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen herunterzuziehen und DNA-Fragmente unerwünschter Größe zu entfernen. Lassen Sie die Perlen fünf Minuten ruhen und übertragen Sie dann den klaren Überstand in ein neues Mikrofugenröhrchen.
Fügen Sie 0,15 mal frische Perlen in den Überstand hinzu und mischen Sie durch Pipettieren gut. Inkubieren Sie die Perlenmischung für fünf Minuten und legen Sie die Röhrchen dann auf einen magnetischen Ständer, um die an die Ziel-DNA gebundenen Perlen herunterzuziehen. Warten Sie fünf Minuten und entsorgen Sie dann den Überstand und behalten Sie die Perlen.
Mit den Perlen auf dem magnetischen Ständer 200 Mikroliter frisch zubereitetes 80% Ethanol hinzufügen und 30 Sekunden warten, bevor Sie das Ethanol entsorgen, ohne die Perlen zu stören. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Ständer und fügen Sie 17 Mikroliter 0,1x TE oder Low TE hinzu, mischen Sie dann durch Pipettieren 10 Mal und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Legen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer und nehmen Sie 15 Mikroliter der größensuchten DNA für PCR-1.
Vortex Streptavidin Perlen und legen Sie sie bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten. Nehmen Sie 32 Mikroliter der Perlen und waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern 1X Bind- und Waschpuffer. Fügen Sie 32 Mikroliter 2X bind und waschen Sie den Puffer hinzu und resuspend die Perlen.
Hinzu kommen 32 Mikroliter der gereinigten PCR-1-Produkte. Gründlich mischen und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Legen Sie die Perlen-DNA-Mischung für zwei Minuten auf einen magnetischen Ständer.
Pipette den Überstand als Biotin-markierte DNA, die den Insertionsrand enthält, an Streptavidin auf den Perlen bindet. Waschen Sie die Perlen mit 500 Mikrolitern 1X Bind und Wash Buffer und waschen Sie die Perlen dann mit 200 Mikrolitern Low TE. Resuspend die DNA-gebundenen Perlen in 17 Mikroliter Low TE. Die DNA der in vivo und in vitro gewachsenen Mutantenbibliotheken, die in einem Ultraschallgerät extrahiert und fragmentiert wurden, zeigte, dass die Mehrheit der Fragmente zwischen 100 und 400 Basenpaaren liegt. Die Lage der transposonvermittelten Insertionen über die vier Replikone des Burkholderia gladioli-Stammes A-Genoms kann in der Schote beobachtet werden.
Eine Zusammenfassung des Sequenzierungsoutputs und der Anzahl der eindeutigen Insertionen und Gene, die in den drei in vivo- und in vitro-Bibliotheken getroffen wurden, kann in der Tabelle beobachtet werden. Es ist wichtig, die Größe des Bevölkerungsengpasses während der Wirtskolonisation zu berechnen, um eine angemessene Darstellung der Bibliothek während der Infektion zu erhalten. Passen Sie auch auf eine kompatible Anzahl von Bakteriengenerationen in vitro und im Wirt an.
Nach der Generierung der Transposon-Mutantenbibliothek kann sie auf selektiven Medien überprüft werden, um Mutanten basierend auf phänotypischen Unterschieden wiederherzustellen. So können spezifische Gene identifiziert werden, die für eine Erkrankung wichtig sind.
