ROMA kann zwischen Organoiden von Patienten mit und ohne Mukoviszidose unterscheiden, wenn weniger als zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen gefunden werden und wenn Schweißfluorid intermediär ist. ROMA kann in jedem Alter und mit niedrigen Komplikationsraten durchgeführt werden. Die Analyse erfolgt halbautomatisch und standardisiert und Biopsien können zur Analyse an ein zentrales Labor geschickt werden.
Organoide, die für ROMA verwendet werden, können auch verwendet werden, um auf die modulatorische Wirksamkeit von CFTR zuzugreifen, und ROMA könnte bei der Messung des Grades der Wiederherstellung der CFTR-Funktion helfen. Einen Tag nach der Beschichtung färben Sie die Organoide mit Kalziumgrün. Drehen und kippen Sie die Platte mit dem Deckel einige Male, um eine homogene Verteilung des Kalziumgrüns im gesamten Vertiefung zu gewährleisten.
Inkubieren Sie die Platte erneut für 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Färbung aller Organoide in den Vertiefungen sicherzustellen. Um auf die Organoide zu fokussieren, bestimmen Sie die optimale X- und Y-Position und fokussieren Sie die Organoide in jeder Vertiefung manuell mit dem konfokalen Mikroskop. Und speichern Sie diese Positionen in der Imaging-Software.
Als nächstes stellen Sie mit Live-Cell-Imaging-Einstellungen die Emission auf 488 Nanometer und die Anregung auf 515 Nanometer und ein LD-Vergrößerungsobjektiv auf 5X ein. Um organoide Bilder aufzunehmen, nehmen Sie Bilder in einer Einheitsrichtung mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln und einer Tiefe von 16 Bit mit dem konfokalen Mikroskop auf. Wählen Sie die Laserintensität und die Masterverstärkung für eine optimale Visualisierung morphologischer Unterschiede zwischen Mukoviszidose- und nicht-zystischen Fibrose-Organoiden.
Starten Sie das Experiment, um die Bilder aufzunehmen. Speichern Sie anschließend ein Bild pro Vertiefung für alle 32 Vertiefungen im Mikroskopformat und exportieren Sie sie als TIFF-Dateien. Laden Sie zunächst die TIFF-Dateien in die Bildanalysesoftware und führen Sie dann die erste Qualitätsprüfung anhand der vom Bediener festgelegten Ausschlusskriterien durch.
Schließen Sie den Satz von Bildern aus, wenn viele differenzierte oder tote Strukturen oder Trümmer vorhanden sind, wenn die Beschichtungsdichte unzureichend ist, wenn zu viele oder zu wenige Organoide vorhanden sind und wenn eine unzureichende Fluoreszenzverteilung vorliegt. Um Bilder für die Analyse vorzubereiten, erstellen und öffnen Sie eine Netzwerkdatendatei aller 32 Bilder für jede Organoidkultur, um die gleichzeitige Analyse aller 32 Bilder pro Subjekt zu ermöglichen. Und kalibrieren Sie Bilder neu, so dass ein Pixel 2,5 mal 2,5 Mikrometer entspricht.
Beschreiben Sie dann Strukturen mit einem niedrigeren Intensitätsschwellenwert von 4, 500 und einem oberen Schwellenwert von 65, 535, schalten Sie die glatten und sauberen Funktionen aus, aktivieren Sie die Funktion für Einfülllöcher und setzen Sie die separate Funktion auf 3X. Um die Organoide zu zählen, wählen Sie alle Strukturen aus, die größer oder gleich 40 Mikrometer sind. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche ND-Messung aktualisieren, und die gezählten Organoide werden nummeriert.
Um Intensität und Zirkularität für die Berechnung zu messen, wählen Sie alle Strukturen größer oder gleich 60 Mikrometer aus und zählen Sie. Entfernen Sie dann alle Strukturen, die die Ränder des Bildes berühren. Als nächstes erodieren Sie ein Pixel vom Rand jeder Struktur, mehr als oder gleich 60 Mikrometer, und messen Sie die mittlere Intensität jeder Struktur.
Wählen Sie anschließend alle Strukturen, die größer oder gleich 60 Mikrometer sind, erneut aus und erodieren Sie 10 Pixel vom Rand jeder Struktur, mehr als oder gleich 60 Mikrometer. Messen Sie dann die mittlere Intensität jeder erodierten Struktur und die Kreisförmigkeit jeder Struktur. Berechnen Sie dann das Intensitätsverhältnis, indem Sie die Intensitätsmessung nach dem Erodieren von 25 Mikrometern vom Rand jeder Struktur um mehr oder gleich 60 Mikrometer durch den Mittelwert der Intensitätsmessung teilen, nachdem 2,5 Mikrometer von der Grenze jeder Struktur erodiert wurden, mehr als oder gleich 60 Mikrometer.
Führen Sie die zweite Qualitätsprüfung anhand der von der Software festgelegten Ausschlusskriterien durch, wie im Manuskript beschrieben. Organoide von 212 Probanden wurden gesammelt und abgebildet. Nach Ausschluss von 23 Bildsätzen, Organoidbildern von 167 Probanden mit Mukoviszidose und zwei krankheitserregenden CFTR-Mutationen und von 22 nicht-mukoviszidose-Probanden wurde eine durchschnittliche Anzahl von Organoiden pro Kultur von 1 519 gefunden.
Das Intensitätsverhältnis und der Zirkularitätsindex wurden für Organoide von Probanden mit und ohne Mukoviszidose bestimmt. Unter Verwendung dieser beiden Indizes wurde eine perfekte Unterscheidung zwischen Organoiden von Probanden mit und ohne Mukoviszidose erzielt, nicht nur wenn Daten aus allen 32 Vertiefungen verwendet wurden, sondern auch, wenn acht Vertiefungen für jede Kultur zufällig ausgewählt wurden. Es wurden Histogramme für vier illustrative Kulturen erhalten, die die Verteilung der Werte für die Zirkularität, die Intensität des zentralen Teils des Organoids und die Intensität des gesamten Organoids zeigen.
Qualitätskontrolle ist unerlässlich, da qualitativ hochwertige Bilder für die genaue Berechnung des Intensitätsverhältnisses und des Zirkularitätsindex erforderlich sind. Organoidkulturen, die für ROMA etabliert wurden, können auch für physikalische Hilfsmittel verwendet werden, um die Wirkung der CFTR-Behandlung zu testen. RNA, DNA und Protein können zur weiteren Charakterisierung von CFTR-Varianten extrahiert werden.
