Dieses Modell stimuliert biomechanische Reize, die glatte Muskelzellen in der menschlichen Aorta erfahren. In Kombination mit Patientenzellen kann dieses System für das Arzneimittelscreening und die personalisierte Medizin von Aortenerkrankungen verwendet werden. Dieses Modell kann die bloßen mechanischen Parameter der glatten Muskelzellen in der menschlichen Aorta nachahmen und präzise steuern, was eine neuartige In-vitro-Plattform für die Untersuchung und Pathogenese von Aortenerkrankungen bietet.
Mieradilijiang Abudubat, ein Posterdoktor aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie mit dem Waschen der rechten lateralen Region der aufsteigenden Aorta mit sterilen pbs, ein- oder zweimal. Entfernen Sie die Intima- und eine Adventitiaschicht des Gewebes mit zwei Augenzangen und behalten Sie die Medienschicht, um die Zellen zu ernten.
Legen Sie die Medienschicht auf eine 10 Zentimeter große Schale und schneiden Sie sie in zwei bis drei Millimeter große Stücke. Dann fügen Sie fünf Milliliter SMCM mit 10% fbs und 1% Penicillin Streptomycin zu den Gewebeproben hinzu. Bewegen Sie das kleine Gewebe mit einer sterilen Pipette in die Kulturflasche und verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig.
Entsorgen Sie das Kulturmedium so weit wie möglich. Dann drehen Sie die Flasche auf den Kopf. Geben Sie zwei Milliliter SMCM in die invertierte Kulturflasche und legen Sie sie für ein bis zwei Stunden mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.
Dann drehen Sie es langsam auf die rechte Seite und fügen Sie weitere zwei Milliliter SMCM hinzu. Nach fünf bis sieben Tagen Inkubation tauschen Sie das SMCM durch vier Milliliter frisches SMCM aus. Verwerfen Sie das SMCM langsam und fügen Sie es hinzu, wenn Sie das Medium wechseln.
Im Allgemeinen klettern sporadische glatte Muskelzellen in etwa zwei Wochen heraus. Transportieren Sie die Kulturflasche vorsichtig, wenn Sie sich zu einer Mikroskopstation bewegen. Andernfalls schwimmen die Gewebe und die Zellen wachsen langsam.
Wenn die Zellen gewachsen sind, teilen Sie sie in zwei neue Kulturflaschen mit vier Milliliter frischem SMCM. Identifizieren Sie die Zellen durch eine Immunfluoreszenzanalyse von vier spezifischen Markern für glatte Muskelzellen. Um PDMS zu polymerisieren, fügen Sie den Härter oder die B-Komponente zur Basis oder zur A-Komponente hinzu und mischen Sie den Komplex fünf Minuten lang.
Das Volumen hängt von der Notwendigkeit der Studie ab. Das vorbereitete PDMS-Gel für 30 bis 60 Minuten in einen Vakuumextraktionstank geben und den Druck unter negativen 0,8 Milli Pascal halten. Entwerfen Sie die Form mithilfe einer computergestützten Konstruktionssoftware.
Maßgeschneiderte Herstellung der Formen der drei Schichten mit einer hochpräzisen numerischen Computer-Steuer-Graviermaschine. Nachdem Sie den Rahmen der Formen und die Mikrokanäle mit PMMA-Platten herausgeschnitten haben, kleben Sie sie auf eine andere Platte. Gießen Sie das vorbereitete PDMS-Gel auf eine entworfene Form.
Dann bei 70 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden vernetzen. Ziehen Sie die vernetzten PDMS-Platten aus der Form ab und schneiden Sie die kommerzialisierten PDMS-Membranen in 100 Millimeter mal 40 Millimeter große Abschnitte. Stanzen Sie Löcher auf den drei PDMs-Platten mit einem Ein-Millimeter-Locher, um den Ein- und Auslass von Luft und mittleren Mikrokanälen auf dem PDMS-Chip zu machen.
Behandeln Sie die drei vorbereiteten PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen fünf Minuten lang mit Sauerstoffplasma für die PDM-Oberflächenaktivierung. Stellen Sie die Raumluft auf Prozessgas, den Druck auf minus 100 Kilopascal, den Strom auf 180 bis 200 Milliampere-Pfeiler, die Spannung auf 200 Volt und die Verarbeitungszeit auf fünf Minuten ein. Verbinden Sie drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen unter einem stereoskopischen Mikroskop miteinander, so dass die oberste Schicht aus der Luftkanal-PDMS-Platte und dann aus der PDMS-Membran besteht.
Der mittlere Kanal besteht aus der PDMS-Platte, dann der PDM-Membran und der unteren Schicht ist die Luftkanal-PDMS-Platte. Legen Sie den bestückten PDMS-Chip für eine Stunde in einen 70-Grad-Inkubator. Bereiten Sie mehrere einen Millimeter Innendurchmesser und drei Zentimeter lange Latexschläuche vor.
Führen Sie einen Millimeter Außendurchmesser und eine einen Zentimeter lange Edelstahlnadel in ein Ende des vorbereiteten Schlauchs ein. Führen Sie dann einen Köder in das andere Ende des Schlauchs ein, um den Schlauch zu erzeugen, der mit den Luft- und Medienmikrokanälen des PDMS-Chips verbunden ist. Stecken Sie die vorbereiteten Röhrchen in die Aus- und Einlässe der Luft- und Medienmikrokanäle auf dem PDMS-Chip.
Infusion von zwei Milliliter 80 Milliliter Mauskollagen in den mittleren Mikrokanal des PDMs-Chips mit einer Zwei-Milliliter-Spritze und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach der Inkubation das Kollagen mit einer Zwei-Milliliter-Spritze aus dem Kanal entfernen. Legen Sie die kollagencodierten PDMS-Chips über Nacht in einen 60-Grad-Inkubator.
Legen Sie die PDMS-Chips für mehr als eine Stunde in einen UV-Sterilisator. Legen Sie die sterilisierten PDMS-Chips auf eine ultrareine Bank, um sich auf das Zellexperiment vorzubereiten. Kultur viermal 10 zu den fünf primären menschlichen glatten Aortenmuskelzellen von Patienten, die SMCM mit 2% FBS und 1% Penicillin Streptomycin in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator verwenden, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Wenn die Zelldichte der glatten Muskulatur 80% erreicht, verwerfen Sie die SMCM und waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PPS. Verdauen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25% Tripsin für zwei Minuten und zentrifugieren Sie bei 100 RCF für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter frischem SMCM.
Verwenden Sie acht Milliliter SMCM, um die Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Kulturschale zu kultivieren. Berechnen Sie mit einem Zytometer die Zellzahl und fahren Sie mit der Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter fort. Gießen Sie langsam zwei Milliliter PBS in den kollagencodierten und sterilisierten PDMS-Chip-Mikrokanal und entsorgen Sie ihn später mit einer Zwei-Milliliter-Spritze.
Gießen Sie langsam zwei Milliliter von zwei mal 10 zu den fünf Zellen pro Milliliter glatter Muskelzellsuspension in den Medienmikrokanal des PDMS-Chips. Schließen Sie dann den Köder am Ein- und Ausgang des PDMS-Chips. Legen Sie den PDMS-Chip in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für einen Tag eingestellt ist.
Nach der Inkubation, wenn die Zellen an der PDMS-Membran im PDMS-Chip befestigt sind, verbinden Sie den Auslass des Luftmikrokanals auf dem PDMS-Chip mit dem Vakuum-Controller-System. Eine längliche normale Zellform wird unter dem Mikroskop gesehen, wenn die Zelle befestigt ist. Im Gegensatz zu den aufgehängten runden Zellen.
Schalten Sie das Magnetventil und die Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie den Vakuumregler und passen Sie das Druckniveau je nach Beanspruchung an. Dann legen Sie die PDMS-Chips und einen Inkubator auf 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden.
Bereiten Sie mehrere Magnetventile, Vakuumfilter, Vakuumregler, eine Vakuumpumpe, eine Schlauchpumpe und eine SPS vor, die das Magnetventil steuert. Programmieren Sie die SPS-Steuerung und stellen Sie das Ein-Aus-Zeitintervall auf ein Hertz ein. Schließen Sie die Magnetventile an die programmierte Steuerung an.
Verbinden Sie den Einlass der Vakuumpumpe mit den Vakuumfiltern und dann den Ausgang der Vakuumfilter mit den Vakuumreglern. Schließen Sie den Ausgang der Vakuumregler an Magnetventile an. Und schließlich verbinden Sie den Ausgang der Magnetventile mit den Auslässen der Luftmikrokanäle der PDMS-Chips.
Verbinden Sie den Ausgang der Schlauchpumpe mit dem Einlass des mittleren Mikrokanals des PDMS-Chips und den Einlass der Schlauchpumpe mit dem Ausgang des mittleren Mikrokanal-PDMS-Chips für den Austausch des Kulturmediums und die Handhabung von Medikamenten. Stellen Sie die Amplitude der Dehnung durch den Regler und die Dehnungsfrequenz durch den Mikrocontroller ein. Die Lebensfähigkeit der menschlichen Zelllinie der glatten Aortenmuskulatur, CRL 1990, im PDMS-Chip wurde unter Verwendung eines Lebend- und Totentests am dritten und fünften Tag der Zellkultur geschätzt.
Die Zelllebensfähigkeit wurde am dritten und fünften Tag über 90% gefunden. Die F-Aktin-Färbung des Zytoskeletts von CRL 1990 im PDMS-Chip zeigte eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 Stunden Dehnung senkrecht zum Stamm ausgerichtet waren. Die Immunfluoreszenz der kontraktilen Marker SM22 und CNN1 war unter Belastungsbedingungen höher als unter statischen Bedingungen.
Auch die SM22- und CNN1-Gene wurden unter Belastungsbedingungen von glatten Muskelzellen hochreguliert. Die F-Aktin-Färbung von BAV und TAV, das thorakale Aortenaneurysma und die Dissektion von patientenabgeleiteten primären menschlichen glatten Aortenmuskelzellen, zeigten eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 Stunden Dehnung senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet waren. Die SM22- und CNN1-Fluoreszenz in BAVTAAD und TAV thorakales Aortenaneurysma und Dissektion waren unter Belastungsbedingungen höher als unter statischen Bedingungen.
Ähnlich wie die Genexpressionsniveaus von SM22 und CNN1, die unter Stammbedingungen im Vergleich zu statischen Bedingungen ebenfalls hochreguliert wurden. Bei der Isolierung von primärem HASMC sollte auf das Prinzip der Sterilität geachtet werden. Nachdem die PDMS-Labore und die Membranen mit Plasma behandelt wurden, sollten die Oberflächen nicht verschmutzt werden.
Basierend auf diesem Protokoll können Endothelzellen mit glatten Muskelzellen kokultiviert werden, und die schiere Belastung kann den Zellen mit zyklischer Belastung gegeben werden, um mehr mechanische Kräfte weiter zu simulieren.
