Diese Methode demonstriert die Verwendung von AML-12-Zellen, die es ermöglichen, Modelle zu erstellen und die schützenden Wirkungen von Platycodin D auf NAFLD zu untersuchen. Die übermäßige Abhängigkeit von der Verwendung von Tiermodellen erhöht die Belastung durch die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel. Die Verwendung von Zellmodellen in der frühen Phase der NAFLD-Arzneimittelentwicklung ist praktischer und kostengünstiger.
Dieses TCM-Modell kann dazu beitragen, das Verständnis der biologischen Funktion von Platycodin D zu verbessern und die Verwendung anderer TCM zur Behandlung von NAFLD zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Aussaat eines Milliliters AML-12-Zellen pro Vertiefung in 12-Well-Platten. Teilen Sie dann die 12-Well-Platte in vier verschiedene Behandlungsgruppen auf und kennzeichnen Sie sie als Kontrollgruppe, PD-behandelt, PA-behandelt und PA plus PD-behandelte Gruppe.
Fügen Sie der Kontroll- und der mit Parkinson behandelten Gruppe einen Milliliter des normalen Zellkulturmediums pro Vertiefung hinzu. Fügen Sie der mit PA behandelten und mit PA plus PD behandelten Gruppe einen Milliliter des normalen Zellkulturmediums hinzu, das mit 300 mikromolare Palmitinsäure ergänzt wurde. Entfernen Sie nach 24 Stunden Inkubation das Kulturmedium der Zellen und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit einem Milliliter serumfreiem Medium.
Als nächstes fügen Sie der Kontrollgruppe einen Milliliter normales Zellkulturmedium hinzu, das mit einem Vehikel ergänzt wurde, und einen Milliliter normales Zellkulturmedium, das mit einem mikromolaren Platycodin D ergänzt wurde, zur mit Parkinson behandelten Gruppe. Fügen Sie der mit PA behandelten Gruppe einen Milliliter normales Zellkulturmedium hinzu, das mit 300 mikromolare Palmitinsäure ergänzt wurde, und einen Milliliter normales Zellkulturmedium, das mit 300 mikromolaren Palmitinsäure und einem mikromolaren Platycodin D ergänzt wurde, zu der mit PA plus PD behandelten Gruppe. Nachdem Sie die Zellen 24 Stunden lang behandelt haben, waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS pro Vertiefung.
Färben Sie die Zellen dann mit 100 Mikrolitern 10 mikromolaren DCFH-DA pro Well. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit 1X PBS und geben Sie einen Milliliter 1X PBS in jede Vertiefung.
Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen bei 200-facher Vergrößerung zu beobachten. Um das mitochondriale Membranpotential zu messen, waschen Sie die zuvor vorbereiteten behandelten Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS pro Vertiefung. Dann färben Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern von fünf Mikrogramm pro Milliliter JC-1-Arbeitslösung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln.
Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 1X PBS und geben Sie einen Milliliter 1X PBS in jede Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen bei 200-facher Vergrößerung zu beobachten. Lysieren Sie die behandelten Zellen und sammeln Sie das Zelllysat in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie dann 5X SDS-PAGE Probenladepuffer in einem Volumenverhältnis von eins zu vier in den Zelllysatüberstand. Als nächstes geben Sie das vorbereitete 12%SDS-PAGE-Gel mit 12 Vertiefungen in den Elektrophoresetank und fügen 1X SDS bis zur empfohlenen Höhengrenze hinzu, verdünnt mit Reinstwasser.
Führen Sie nach der SDS-PAGE-Elektrophorese den Elektrotransfer der Proteine auf eine 0,45 μm PVDF-Membran durch. Inkubieren Sie die Membran in fünf Millilitern der Primärantikörper, die in Blockierungspuffer verdünnt sind. Verwenden Sie Antikörper, die spezifisch für LC-III, p62 und Beta-Aktin sind.
Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dann inkubieren Sie die PVDF-Membran mit einem Kaninchen-Anti-Maus-LGG-HRP-Sekundärantikörper, der im Blockierungspuffer auf 10.000 verdünnt ist. Inkubieren Sie die Membran zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.
Legen Sie die PVDF-Membran nach der Inkubation auf eine Plastikfolie. Fügen Sie eine angemessene Menge ECL-Arbeitslösung hinzu und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Entfernen Sie dann die ECL-Arbeitslösung und belichten Sie die PVDF-Membran im Bildgebungssystem zur Bildentwicklung.
Die DCFH-DA-Färbung zeigte, dass Platycodin D den intrazellulären ROS-Spiegel in den ALM-12-Zellen signifikant reduzieren konnte, was darauf hindeutet, dass diese Behandlung den zellulären oxidativen Stress reduzieren kann. Darüber hinaus war die grüne Fluoreszenz, die JC-1-Monomere oder depolarisierte Mitochondrien darstellte, in den mit Palmitinsäure behandelten Zellen höher als in den unbehandelten Zellen, während die rote Fluoreszenz, die die JC-1-Dimere oder polarisierten Mitochondrien darstellte, in den mit Palmitinsäure behandelten Zellen niedriger war als in den unbehandelten Zellen, was auf eine Palmitinsäure-induzierte MMP-Depolarisation hinweist. Darüber hinaus nahm im Vergleich zur Modellgruppe das Verhältnis von JC-1-Monomeren zu Dimeren in der Platycodin-D-Behandlungsgruppe ab, was darauf hindeutet, dass es das Palmitinsäure-induzierte MMP verbessern könnte.
Die Proteinexpressionsniveaus der Autophagie-verwandten Proteine LC-III und p62 wurden mittels Western Blot untersucht. Das Verhältnis von LC-32 zu LC-31 nahm signifikant ab und das Proteinexpressionsniveau von p62 stieg nach Behandlung mit Palmitinsäure an. Auf der anderen Seite reduzierte Platycodin D signifikant das Proteinexpressionsniveau von p62 und erhöhte das Verhältnis von LC-32 zu LC-31, was auf eine Wiederherstellung des durch Palmitinsäure induzierten autophagischen Flusses hinweist.
Wenn der Fluoreszenzwert der Zellen in der Negativkontrollgruppe relativ hoch ist, können die Arbeitskonzentrationen der Fluoreszenzsonden nach Bedarf angepasst werden.
