Preparación de combinados lisado plaquetario humano (pHPL) como un suplemento eficaz de los animales libres de suero humano culturas de células madre

Resumen

Lisado de plaquetas humanas es una rica fuente de factores de crecimiento y un suplemento potente en cultivo celular. Este protocolo se presenta el proceso de preparación de una gran cantidad de lisado de plaquetas humanas, partiendo de plasma rico en plaquetas, la realización de varios ciclos de congelación-descongelación y el agotamiento de los fragmentos de plaquetas.

Resumen

Factores de crecimiento derivados de plaquetas se ha demostrado que estimulan la proliferación celular de manera eficiente

Protocolo

1. Material de partida

Comience con plasma rico en plaquetas (PRP) unidades preparadas por citaféresis o derivados de buffy abrigos.

2. Comprobar la esterilidad

Para comprobar la esterilidad tomar una muestra de 20 ml de cada unidad de PRP mediante la transferencia del volumen de una bolsa conectada pequeños (Baxter). Desconecte esta bolsa por soldadura.

3. La congelación de las unidades de PRP

Inmediatamente después de la preparación, congelación de las unidades de PRP hasta al menos -20 ° C en la bolsa de almacenamiento original, sin manipulación.

4. Descongelación de las unidades de HPL

Cuando los ensayos con bacterias son negativos, descongelar humanos unidades lisado de plaquetas, que ahora se llama unidades de HPL a 37 ° C (baño de agua) hasta que la formación de coágulos de hielo desaparecen. No caliente el HPL.

5. Puesta en común de las unidades de HPL

Tomar por lo menos diez a quince unidades descongelado HPL para una piscina lisado de plaquetas para preparar un producto estandarizado. Conecte las bolsas de HPL consecutiva a la bolsa de la puesta en común de matrimonio (MacoPharma) y la transferencia de la HPL en estas dos bolsas. Desconecte las bolsas vacías HPL por soldadura. Obtener un volumen final de 3 a 4 litros de combinado lisado de plaquetas humanas (pHPL) al mezclar el contenido de las dos bolsas. Conecte una bolsa pequeña (Baxter) y tomar una muestra de 20 ml pHPL para comprobar la esterilidad del producto combinado. Desconecte esta bolsa por soldadura.

6. Porcionado de la pHPL

Parte de la pHPL para obtener alícuotas adecuadas para su posterior procesamiento. Conectar pequeñas bolsas (Baxter) a la bolsa de la puesta en común de matrimonio (MacoPharma) y la transferencia de volúmenes de hasta 250 ml a las bolsas de almacenamiento de pequeño (Baxter). Desconecte las bolsas llenas de soldadura.

7. Volver a la congelación de las alícuotas pHPL

Aumentar la tasa de fragmentación de las plaquetas y la cantidad de factores de crecimiento liberados por otros de congelación / descongelación paso. Congelar las pequeñas bolsas de pHPL porciones de nuevo por lo menos a -20 ° C.

8. Re-descongelación y dosificación de las alícuotas pHPL

Descongele las bolsas pHPL a 37 ° C (baño de agua). Transferir el contenido en viales de 50 ml (Falcon BD) por cortar el tubo de la bolsa con unas tijeras estériles y verter el pHPL en los viales. Realice este paso en un banco de flujo laminar para evitar la contaminación bacteriana o micótica.

9. Extirpación de los fragmentos de plaquetas

Como fragmentos de plaquetas tienden a agruparse y puede inducir a aloinmunización, sacarlos de la pHPL. Centrifugue los viales pHPL por lo tanto, a 4.000 g (15 minutos, 4 ° C). En una pipeta banco de flujo laminar el plasma sobrenadante en los viales de almacenamiento final (Falcons BD) y desechar los gránulos de las plaquetas a evitar los fragmentos en cultivos celulares.

10. Almacenamiento de pHPL

Congelar las alícuotas de 50 ml viales pHPL de nuevo en menos de 20 ° C y almacenarlos para su uso experimental.

11. El uso de pHPL en cultivo celular

Inicialmente añadir heparina sin conservantes para el medio para evitar la formación de gel. Descongelar una alícuota de pHPL a 37 ° C y complementar el medio de cultivo mediante la adición de 8 a 10%.

Medios

MSC-Media:

Utilizar 500 ml de una MEM, añadir 56 ml de descongelado pHPL (véase también la referencia 1 para más detalles) e IU 2 / ml (= l de solución madre 224) de la heparina sin conservantes (evita la coagulación del medio a través de la formación de grumos el fibrinógeno en el plasma) para alcanzar una concentración final del 10% pHPL. Además añade la penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100μg/mL) y la solución 2 mM de L-glutamina (Sigma ambos).

Filtrar el medio a través de 20 micras de poro del filtro de vacío de tamaño (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha).

ECFC-Media:

Utilice una botella (500 ml) de la MBE, añadir las alícuotas de citoquinas, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de la solución madre) sin conservantes heparina, penicilina (100U/mL) / estreptomicina (100 g / ml) y 2 mM de L-glutamina en el medio basal y el filtro con 20 l-de tamaño de poro del filtro de vacío (Millipore). Etiqueta de la botella adecuadamente (contenido, la fecha).

Figura 1: Preparación de plasma rico en plaquetas a partir de una donación de sangre total de un banco de sangre local o cualquier otro proveedor autorizado. Después de la centrifugación de la sangre puede ser separada en plasma, la capa leucocitaria y los glóbulos rojos. Cuatro unidades de la capa leucocitaria, grupo sanguíneo O y un grupo sanguíneo AB plasma pueden agruparse antes de la centrifugación para separar el plasma rico en plaquetas. Una calidad regular rico en plaquetas unidad de plasma de aproximadamente 300 ml debe contener 1x10 ⁹ plaquetas por ml o 3x10 platele ¹¹ts total.

Discusión

En algunas regiones de plaquetas en plasma rico (PRP) se puede obtener a partir de buffy-coats de lo contrario ser un producto de desecho de concentrados de la producción de glóbulos rojos a partir de donaciones de sangre analizadas (Figura 1). En condiciones óptimas, PRP se utiliza inmediatamente para su posterior elaboración de pHPL, como en las plaquetas obsoletas se concentra la disponibilidad de factores de crecimiento puede ser reducida debido a las lesiones de almacenamiento de plaquetas y la degradación

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double bag (2 x 3.5L)	MacoPharma	VDL 8000XQ	originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube	Falcon BD	2098
50 mL Stripettes	Costar	4501
Plasma bags (600mL)	Baxter Internationl Inc.	R4R2021
Sterile tubing welder	Terumo Medical Corp.	TSCD-II
Welding equipment	Fresenius Kabi	Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge