Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen

Zusammenfassung

Menschliche Thrombozyten-Lysat ist eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren und eine starke Ergänzung in der Zellkultur. Dieses Protokoll stellt den Prozess der Vorbereitung einen großen Pool an menschlichen Thrombozyten-Lysat ausgehend von platelet rich plasma, Durchführung mehrerer Gefrier-Auftau-Zyklen und zum Abbau der Thrombozyten-Fragmente.

Zusammenfassung

Platelet derived growth Faktoren haben gezeigt, dass die Zellproliferation effizient stimulieren

Protokoll

1. Ausgangsmaterial

Beginnen Sie mit Thrombozyten-reichem Plasma (PRP) Einheiten durch Zytopherese oder aus Buffy Coats.

2. Sterilität zu überprüfen

Für die Sterilität zu überprüfen eine Probe von 20 ml aus jedem PRP-Einheit durch die Übertragung der Lautstärke auf einem angeschlossenen kleinen Beutel (Baxter). Trennen Sie diese Tasche durch Schweißen.

3. Einfrieren von PRP-Einheiten

Unmittelbar nach der Herstellung, frieren die PRP-Einheiten bis mindestens -20 ° C in der ursprünglichen Aufbewahrungstasche ohne weitere Manipulation.

4. Auftauen von HPL-Einheiten

Wenn bakteriellen Tests negativ sind, Tauwetter menschlichen Thrombozyten-Lysat Einheiten, die heute als HPL-Einheiten bei 37 ° C (Wasserbad), bis das Eis Blutgerinnsel verschwinden. Nicht erwärmen die HPL.

5. Pooling von HPL-Einheiten

Nehmen Sie sich mindestens 10 bis 15 aufgetaut HPL-Einheiten für eine Thrombozyten-Lysat-Pool, ein standardisiertes Produkt vorbereiten. Schließen Sie das HPL Beutel nacheinander auf die Zusammenlegung doppelten Beutel (MacoPharma) und übertragen Sie die HPL in diese beiden Taschen. Trennen Sie die leere HPL Beutel verschweißt. Holen Sie sich ein Gesamtvolumen von 3 bis 4 L von gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) durch Mischen der Inhalt der beiden Tüten. Schließen Sie eine kleine Tasche (Baxter) und nehmen Sie eine Probe von 20 mL PHPL für Sterilität Überprüfung der gepoolten Produkt. Trennen Sie diese Tasche durch Schweißen.

6. Portionieren der PHPL

Portion der PHPL geeignete Aliquots für die weitere Verarbeitung zu bekommen. Connect kleine Beutel (Baxter), um die Bündelung doppelten Beutel (Macopharma) und Transfer Volumen von bis zu 250 mL der kleinen Säcken zur Lagerung (Baxter). Trennen Sie die gefüllten Säcke durch Schweißen.

7. Re-Einfrieren der PHPL Aliquots

Erhöhung des Anteils der Thrombozyten-Fragmentierung und die Menge des freigesetzten Wachstumsfaktoren durch einen weiteren Frost / Tau-Schritt. Frieren Sie den kleinen Beutel portioniert PHPL wieder bei mindestens -20 ° C.

8. Re-Auftau-und Portionierung des PHPL Aliquots

Auftauen PHPL Beutel bei 37 ° C (Wasserbad). Übertragen Sie die Inhalte in 50 ml-Fläschchen (Falcons BD), indem das Rohr des Beutels mit einer sterilen Schere und Gießen der PHPL in das Fläschchen. Führen Sie diesen Schritt in einer laminaren Strömung Bank, um bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination zu vermeiden.

9. Entfernen von Thrombozyten-Fragmente

Da Thrombozyten-Fragmente zur Aggregation neigen und kann Alloimmunisierung induzieren, entfernen Sie sie aus dem PHPL. Zentrifugieren Sie die PHPL Fläschchen daher bei 4.000 g (15 Minuten, 4 ° C). In einer laminaren Strömung Bank Pipette der Überstand Plasma in die Endlagerung Fläschchen (Falcons BD) und entsorgen Sie die Thrombozyten-Pellets zu vermeiden Fragmente in der Zellkultur.

10. Speicherung von PHPL

Freeze-Aliquots von 50 ml Fläschchen PHPL wieder mindestens-20 ° C und lagern Sie sie zu Versuchszwecken verwendet.

11. Verwendung von PHPL in der Zellkultur

Zunächst fügen Sie frei von Konservierungsmitteln Heparin auf die mittel-bis Gelbildung zu vermeiden. Tauwetter ein PHPL Aliquot bei 37 ° C und ergänzen das Kulturmedium durch Zugabe von 8 bis 10%.

Medien

MSC-Medium:

Verwenden Sie 500 ml a-MEM, fügen Sie 56 ml des aufgetauten PHPL (siehe auch Hinweis 1 für weitere Details) und 2 IU / mL (= 224 ul der Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin (verhindert Koagulation des Mediums durch Verklumpung der das Fibrinogen im Plasma), um eine endgültige Konzentration von 10% PHPL. Zusätzlich fügen Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100μg/mL)-Lösung und 2 mM L-Glutamin (beide Sigma).

Filter das Medium, durch ein 20 um-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum).

ECFC-Medium:

Verwenden Sie eine Flasche (500 ml) von EBM, fügen Sie die Zytokin-Aliquots, 56 ml PHPL, 10 IU / ml (= 1120μl Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin, Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100 g / ml)-Lösung und 2 mM L-Glutamin, die Basalmedium und Filter mit 20 ul-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum).

Abbildung 1: Herstellung von Plättchen-reiches Plasma aus einer Vollblutspende von einem lokalen Blutbank oder anderen zugelassenen Anbieter. Nach Zentrifugation kann das Blut in Plasma, Buffy Coat und Erythrozyten getrennt werden. Vier Buffy-Coat-Einheiten, Blutgruppe O und eine Blutgruppe AB Plasma kann gebündelt vor der Zentrifugation der Blutplättchen reiches Plasma getrennt zu sein. Eine regelmäßige Qualitätskontrollen Plättchen-reiches Plasma-Einheit von etwa 300 ml enthalten sollte 1x10 ⁹ Thrombozyten pro ml oder 3x10 ¹¹ platelets insgesamt.

Diskussion

In einigen Regionen platelet rich plasma (PRP) kann von Buffy-Coats sonst, ein Abfallprodukt der gepackten roten Blutkörperchen aus getestet Blutspenden (Abbildung 1) erreicht werden. Optimal ist PRP sofort für die weitere Bearbeitung von PHPL verwendet, wie in veralteten Thrombozytenkonzentraten die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren können durch Thrombozyten-Lagerung Läsionen und Abbau ²⁰ reduziert werden. Es wird ferner empfohlen, PRP durch Anpassung Thrombozyten der Blutgruppe O mit Plasma der Blutg...

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Double bag (2 x 3.5L)		MacoPharma	VDL 8000XQ	originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube		Falcon BD	2098
50 mL Stripettes		Costar	4501
Plasma bags (600mL)		Baxter	R4R2021
Sterile tubing welder		Terumo	TSCD-II
Welding equipment		Fresenius Kabi	Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge