Preparazione del pool lisato piastrinico umani (pHPL) come supplemento efficiente per animali siero-Free Culture sulle cellule staminali umane

Riepilogo

Umano lisato piastrinico è una ricca fonte di fattori di crescita e di un supplemento potente nelle cellule in coltura. Questo protocollo presenta il processo di preparazione di un ampio pool di lisato piastrinico umano partendo da plasma ricco di piastrine, eseguendo numerosi cicli di gelo-disgelo e riducono i frammenti delle piastrine.

Abstract

Fattori di crescita derivato dalle piastrine hanno dimostrato di stimolare la proliferazione cellulare in modo efficiente

Protocollo

1. Materiale di partenza

Inizia con plasma ricco di piastrine (PRP) unità preparata da cytapheresis o derivati ​​da buffy cappotti.

2. Sterilità controllo

Per verificare la sterilità prendere un campione di 20 mL da ciascuna unità PRP, trasferendo il volume ad un sacchetto collegato piccolo (Baxter). Scollegare questa borsa mediante saldatura.

3. Congelamento delle unità di PRP

Immediatamente dopo la preparazione, congelare le unità PRP fino ad almeno -20 ° C nel sacchetto originale senza ulteriori manipolazioni.

4. Scongelamento delle unità di HPL

Quando i test batterici sono negativi, disgelo umano unità di lisato piastrinico, ora si chiama unità di HPL a 37 ° C (bagno d'acqua) fino a quando i grumi di ghiaccio scompaiono. Non riscaldare il HPL.

5. Messa in comune delle unità di HPL

Prendere almeno 10-15 unità scongelati HPL per un pool di lisato piastrinico per preparare un prodotto standardizzato. Collegare le sacche HPL consecutivamente per la borsa pooling doppio (MacoPharma) e trasferire la HPL in questi due sacchi. Scollegare le borse vuote HPL mediante saldatura. Ottenere un volume finale di 3 a 4 L di pool di lisato piastrinico umano (pHPL) mescolando il contenuto delle due borse. Collegare un piccolo sacchetto (Baxter) e prendere un campione di 20 mL pHPL per controllare la sterilità del prodotto in pool. Scollegare questa borsa mediante saldatura.

6. Porzionatura dei pHPL

Parte il pHPL per ottenere aliquote adatto per ulteriori elaborazioni. Collegare sacchetti di piccole dimensioni (Baxter) per la borsa pooling doppio (Macopharma) e il trasferimento di volumi fino a 250 ml per le borse di storage di piccole dimensioni (Baxter). Scollegare i sacchi pieni di saldatura.

7. Re-congelamento delle aliquote pHPL

Aumentare il tasso di frammentazione delle piastrine e la quantità di fattori di crescita rilasciati da un ulteriore gelo / disgelo passo. Congelare i sacchetti di pHPL porzionato di nuovo almeno -20 ° C.

8. Re-scongelamento e porzionatura del aliquote pHPL

Scongelare le borse pHPL a 37 ° C (bagno d'acqua). Trasferire il contenuto in flaconcini da 50 ml (Falcons BD) tagliando il tubo del sacchetto con le forbici sterili e versare il pHPL in fiale. Eseguire questo passaggio in un banco a flusso laminare per evitare contaminazioni batteriche o fungine.

9. Rimozione di frammenti di piastrine

Come frammenti di piastrine tendono ad aggregarsi e possono indurre alloimmunizzazione, rimuoverli dalla pHPL. Centrifugare le provette pHPL quindi a 4.000 g (15 minuti, 4 ° C). In una pipetta da banco a flusso laminare il plasma surnatante in fiale stoccaggio finale (Falchi BD) e scartare il pellet di piastrine per evitare di frammenti in coltura cellulare.

10. Conservazione dei pHPL

Congelamento aliquote di 50 ml fiale pHPL ancora almeno-20 ° C e conservarle per uso sperimentale.

11. L'uso di pHPL in coltura cellulare

Inizialmente aggiungere eparina senza conservanti al mezzo per evitare la formazione di gel. Scongelare un'aliquota pHPL a 37 ° C e integrare il terreno di coltura con l'aggiunta di 8 - 10%.

Mezzi

MSC-media:

Utilizzare 500 ml di a-MEM, aggiungere 56 ml di scongelato pHPL (vedi anche riferimento 1 per ulteriori dettagli) e 2 IU / mL (= ml di soluzione madre 224) senza conservanti di eparina (evita la coagulazione del mezzo attraverso aggregazione di il fibrinogeno nel plasma) per raggiungere una concentrazione finale del 10% pHPL. Inoltre aggiungere penicillina (100U/mL) / streptomicina (100μg/mL) soluzione e 2mM di L-Glutamin (entrambi Sigma).

Filtrare il medium attraverso un poro 20 micron filtro dimensioni del vuoto (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).

ECFC-media:

Utilizzare una bottiglia (500 ml) di EBM, aggiungere il citochine aliquote, 56 ml di pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl di soluzione madre) di conservanti eparina, penicillina (100U/mL) / Streptomicina (100 g / mL) e 2mM soluzione di L-Glutamin al mezzo basale e il filtro con 20 l poro vuoto dimensione del filtro (Millipore). Etichetta della bottiglia appropriato (contenuto, data).

Figura 1: Preparazione del plasma ricco di piastrine da una donazione di sangue intero da una banca del sangue locale o qualsiasi altro provider autorizzati. Dopo la centrifugazione del sangue può essere separato in plasma, buffy coat e globuli rossi. Quattro unità buffy coat, gruppo sanguigno O e un gruppo sanguigno AB plasma può essere raggruppati prima centrifugazione per separare il plasma ricco di piastrine. A regolare la qualità ricco di piastrine unità di plasma di circa 300mL dovrebbe contenere 1x10 ⁹ piastrine per ml o 3x10 ¹¹ platelets totale.

Discussione

In alcune regioni plasma ricco di piastrine (PRP) possono essere ottenuti da buffy-coat altrimenti essendo un prodotto di scarto della confezionato produzione di globuli rossi da donazioni di sangue testato (Figura 1). In modo ottimale, PRP viene utilizzata immediatamente per l'ulteriore preparazione di pHPL, come in piastrine superata concentra la disponibilità di fattori di crescita può essere ridotta a causa di lesioni di stoccaggio delle piastrine e la degradazione ^20. Si raccomanda inoltre di produ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double bag (2 x 3.5L)	MacoPharma	VDL 8000XQ	originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube	Falcon BD	2098
50 mL Stripettes	Costar	4501
Plasma bags (600mL)	Baxter Internationl Inc.	R4R2021
Sterile tubing welder	Terumo Medical Corp.	TSCD-II
Welding equipment	Fresenius Kabi	Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge