הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Summary

Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.

Abstract

טסיות דם גורמי גדילה שמקורם הוכחו לעורר התפשטות תאים ביעילות

Protocol

1. החל החומר

התחל עם טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) שהוכן על ידי יחידות cytapheresis או נגזר באפי מעילים.

2. עקרות לבדוק

במשך עקרות לבדוק לקחת דגימה של 20 מ"ל של כל יחידה PRP ידי העברת נפח שקית קטנה מחוברת (Baxter). נתק את התיק הזה על ידי ריתוך.

3. הקפאה של יחידות PRP

מיד לאחר ההכנה, להקפיא את יחידות PRP עד לפחות -20 ° C בשקית אחסון המקורי ללא מניפולציה נוספת.

4. הפשרת יחידות HPL

כאשר בדיקות חיידקים שליליים, להפשיר האנושי יחידות lysate טסיות דם, הנקרא כיום יחידות HPL ב 37 ° C (אמבט מים) עד קרישי קרח להיעלם. אין לחמם את HPL.

5. איגום של יחידות HPL

קח לפחות 10-15 יחידות HPL מופשר במשך בשלולית lysate טסיות להכין מוצר סטנדרטי. חבר את שקיות HPL ברציפות לשקית כפולה איגום (MacoPharma) ולהעביר את HPL לתוך שתי שקיות. נתק את שקיות HPL ריק על ידי ריתוך. קבל נפח הסופי של L 3-4 של lysate ונקווה טסיות הדם האנושי (pHPL) על ידי ערבוב את התוכן של שתי שקיות. חבר תיק קטן (Baxter) ולקחת מדגם של 20 מ"ל pHPL לבדיקה סטריליות המוצר ונקווה. נתק את התיק הזה על ידי ריתוך.

6. Portioning של pHPL

PHPL פרשת לקבל aliquots מתאים לעיבוד נוסף. חבר בשקיות קטנות (Baxter) לשקית איגום כפול (Macopharma) ולהעביר כמויות של עד 250 מ"ל של שקיות אחסון קטן (Baxter). נתק את שקיות מלאות על ידי ריתוך.

7. Re-הקפאה של aliquots pHPL

הגדלת שיעור הפיצול הטסיות וכמות גורמי גדילה שפורסמו על ידי צעד הקפאה / הפשרה נוספת. להקפיא את שקיות קטנות של pHPL במנות שוב לפחות -20 ° C.

8. Re-מפשיר portioning של aliquots pHPL

ההפשרה שקיות pHPL ב 37 ° C (אמבט מים). מעבירים את תוכן לתוך צלוחיות 50 מ"ל (פלקונס BD) על ידי חיתוך הצינור של התיק באמצעות מספריים סטרילית לשפוך את pHPL לתוך צלוחיות. בצע פעולה זו על ספסל זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי.

9. הסרת שברי טסיות

כמו שברי טסיות נוטים לצבור ועלול לגרום alloimmunization, להסיר אותם מן pHPL. צנטריפוגה צלוחיות pHPL ולכן ב 4000 גרם (15 דקות, 4 ° C). ב פיפטה זרימה למינרית הספסל פלזמה supernatant לתוך צלוחיות אחסון הסופי (פלקונס BD) וזורקים את כדורי טסיות הדם, כדי למנוע שברים בתרבות התא.

10. אחסון של pHPL

הקפאת aliquots של 50 בקבוקונים מ"ל pHPL שוב לפחות-20 ° C ולאחסן אותם לשימוש ניסיוני.

11. השימוש pHPL בתרבות התא

בתחילה להוסיף הפרין ללא חומר משמר עד בינוני, כדי למנוע היווצרות קריש. הפשרה aliquot pHPL ב 37 ° C ו מוסף התרבות בינוני על ידי תוספת של 8 - 10%.

מדיומים

MSC-בינונית:

השתמש ב 500 מ"ל של-ממ, להוסיף 56 מ"ל של pHPL מופשר (ראה גם התייחסות 1 לפרטים נוספים) ו 2 IU / mL (= 224 μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם (מונע קרישה של המדיום דרך ובהצטברויות פיברינוגן של פלזמה) להגיע הריכוז הסופי של pHPL 10%. בנוסף להוסיף פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100μg/mL) פתרון של 2 מ"מ L-Glutamin (הן סיגמא).

סינון בינוני באמצעות מסנן 20 מיקרומטר, גודל הנקבוביות ואקום (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן).

ECFC-בינונית:

השתמש בקבוק אחד (500 מ"ל) של EBM, מוסיפים את ציטוקינים-aliquots, 56 מ"ל של pHPL, 10 IU / מ"ל ​​(= 1120μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם, פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100 גר '/ מ"ל) פתרון של 2 מ"מ L-Glutamin עד בינוני המסנן הבסיס, עם 20 μl-נקבוביות ואקום גודל המסנן (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן).

איור 1: הכנת פלזמה טסיות דם עשיר מתרומת דם כל מבנק הדם המקומית או כל ספקית אחרת שאושרה. לאחר צנטריפוגה לדם ניתן לחלק פלזמה, באפי מעיל כדוריות דם אדומות. ארבע יחידות באפי מעיל, דם O קבוצה אחת קבוצה דם AB פלזמה ניתן ונקווה לפני צנטריפוגה להפריד את הפלזמה העשירה בטסיות. איכות רגילה טסיות עשיר פלזמה יחידה של כ 300 מ"ל יכילו 1x10 ⁹ טסיות לכל מ"ל או 3x10 ¹¹ platelets מוחלט.

Discussion

באזורים מסוימים טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) ניתן לקבל אצל באפי, מעילים אחרת שהוא תוצר פסולת של ארז ייצור תאים דם אדומים מתרומות דם שנבדקו (איור 1). באופן אופטימלי, PRP משמש מיד להכנת נוספת של pHPL, כמו טסיות מיושן מרכזת את הזמינות של גורמי גדילה עשוי להיות מופחת בשל נגעים אחסון ?...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Double bag (2 x 3.5L)		MacoPharma	VDL 8000XQ	originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube		Falcon BD	2098
50 mL Stripettes		Costar	4501
Plasma bags (600mL)		Baxter	R4R2021
Sterile tubing welder		Terumo	TSCD-II
Welding equipment		Fresenius Kabi	Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge