Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Resumo

Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.

Resumo

Fatores de crescimento plaquetário derivados têm sido mostrados para estimular a proliferação celular de forma eficiente

Protocolo

1. Material de partida

Comece com plaquetas plasma rico (PRP) unidades preparadas por Citaferese ou derivados de buffy casacos.

2. Verificar a esterilidade

Para verificar a esterilidade tirar uma amostra de 20 mL de cada unidade PRP, transferindo o volume para uma bolsa pequena conectado (Baxter). Desconecte este saco com solda.

3. Congelamento de unidades PRP

Imediatamente após a preparação, congelar as unidades PRP até pelo menos -20 ° C no saco de armazenamento original, sem manipulação posterior.

4. Descongelamento das unidades HPL

Quando os testes bacteriana são negativos, descongele humana unidades lisado de plaquetas, agora chamados de unidades HPL a 37 ° C (banho de água) até que os coágulos de gelo desaparecer. Não aqueça o HPL.

5. Agrupamento de unidades de HPL

Tome pelo menos 10-15 descongelado unidades HPL para um pool de plaquetas lisado para preparar um produto padronizado. Conectar os sacos HPL consecutivamente para o saco de pooling de casal (MacoPharma) e transferir o HPL nesses dois sacos. Desligue o sacos vazios HPL por soldadura. Obter um volume final de 3 a 4 L de pooled lisado de plaquetas humanas (pHPL), misturando o conteúdo dos dois sacos. Conectar um pequeno saco (Baxter) e tirar uma amostra de 20 mL para pHPL verificar a esterilidade do produto em pool. Desconecte este saco com solda.

6. Porcionamento do pHPL

PHPL a parte para obter alíquotas adequadas para processamento posterior. Conectar pequenos sacos (Baxter) para o saco de pooling de casal (Macopharma) e transferência de volumes de até 250 mL para os sacos de armazenamento pequeno (Baxter). Desconecte os sacos cheios de soldagem.

7. Re-congelamento das alíquotas pHPL

Aumentar a taxa de fragmentação de plaquetas e da quantidade de fatores de crescimento liberados por uma etapa de congelamento / descongelamento mais. Congelar os pequenos sacos de pHPL porções de novo, pelo menos, -20 ° C.

8. Re-descongelamento e porcionamento das alíquotas pHPL

Descongelar os sacos pHPL a 37 ° C (banho de água). Transferir o conteúdo em frascos de 50 ml (Falcons BD), cortando o tubo do saco com uma tesoura esterilizada e derramar o pHPL para os frascos. Realizar esta etapa em um banco de fluxo laminar para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica.

9. Remoção de fragmentos de plaquetas

Como fragmentos de plaquetas tendem a se agregar e pode induzir a aloimunização, removê-los do pHPL. Centrifugue os tubos pHPL, portanto, a 4.000 g (15 minutos, 4 ° C). Em uma pipeta bancada de fluxo laminar o plasma sobrenadante para os frascos de armazenamento final (Falcons BD) e descartar as pelotas de plaquetas para evitar fragmentos em cultura de células.

10. Armazenamento de pHPL

Congelar alíquotas de 50 mL pHPL novamente em menos 20 ° C e armazená-los para uso experimental.

11. Uso de pHPL em cultura de células

Inicialmente adicionar heparina sem conservantes para o meio para evitar a formação de gel. Descongelar uma alíquota pHPL a 37 ° C e completar o meio de cultura pela adição de 8-10%.

Médiuns

MSC Médio:

Use 500 mL de uma MEM, adicione 56 ml de pHPL descongelados (ver também referência 1 para mais detalhes) e 2 UI / mL (= 224 ml de solução-estoque) de heparina sem conservantes (evita a coagulação do meio através do acúmulo de o fibrinogênio no plasma) para alcançar uma concentração final de pHPL 10%. Além disso adicionar penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100μg/mL) e solução de 2mM de L-glutamina (ambos Sigma).

Filtrar o meio através do filtro a vácuo a 20 mM de poros tamanho (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).

ECFC-Medium:

Use uma garrafa (500 ml) de EBM, adicionar as alíquotas de citocinas, 56 mL de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl da solução de reserva) de conservante livre de Heparina, Penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100 g / mL de solução) e 2mM de L-glutamina ao meio basal e com um filtro de 20 l de poros tamanho vácuo filtro (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).

Figura 1: Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de uma doação de sangue total de um banco de sangue local ou qualquer outro fornecedor autorizado. Após a centrifugação do sangue pode ser separado em plasma, buffy coat e células vermelhas do sangue. Quatro unidades de buffy coat, o grupo sanguíneo O e um grupo sanguíneo AB plasma podem ser combinadas antes da centrifugação para separar o plasma rico em plaquetas. A regularidade de qualidade unidade de plasma rico em plaquetas de aproximadamente 300mL deve conter 1x10 ⁹ plaquetas por ml ou ¹¹ 3x10 plateletotal de ts.

Discussão

Em algumas regiões de plaquetas plasma rico (PRP) podem ser obtidas buffy-coats de outra forma de ser um produto embalado resíduos de produção de glóbulos vermelhos a partir de doações de sangue testadas (Figura 1). Idealmente, PRP é usado imediatamente para melhor preparação de pHPL, como em plaquetas desatualizado concentra a disponibilidade de fatores de crescimento pode ser reduzido devido a lesões de armazenamento de plaquetas e degradação ^20. Recomenda-se ainda para produzir PRP combinando ...

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Double bag (2 x 3.5L)		MacoPharma	VDL 8000XQ	originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube		Falcon BD	2098
50 mL Stripettes		Costar	4501
Plasma bags (600mL)		Baxter	R4R2021
Sterile tubing welder		Terumo	TSCD-II
Welding equipment		Fresenius Kabi	Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge