Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Resumen

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Resumen

El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende del patrón único de bandas de cada cromosoma en una especie en particular se analizaron ^{1, 2.} Esta técnica clásica anillamiento, sin embargo, no es fiable en la identificación de complejos aberraciones cromosómicas tales como aquellas asociadas con el cáncer. Para superar las limitaciones de la técnica de bandeo, cariotipo espectral (SKY) se introdujo para proporcionar mayor cantidad de información fiable sobre las anomalías cromosómicas.

SKY es una fluorescencia multicolor de hibridación in situ (FISH) para detectar los cromosomas en metafase con el microscopio espectral de ^{3, 4.} SKY ha sido demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis citogenético de una amplia gama de anomalías cromosómicas asociadas con un gran número de enfermedades genéticas y enfermedades malignas ^{5, 6.} CIELO implica el uso de sondas de ADN multicolores fluorescentemente-etiquetados preparados a partir de la oligonucleótidos degeneradoscebadores otide por PCR. Así, cada cromosoma tiene un color único espectral después de hibridación in situ con sondas, que están diferencialmente etiquetados con una mezcla de tintes fluorescentes (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC y Cy5.5). Las sondas utilizadas para SKY constar de hasta 55 sondas cromosómicas específicas ^7-10.

El procedimiento para SKY implica varios pasos (Figura 1). CIELO requiere la disponibilidad de células con alto índice mitótico a partir de tejido normal o enferma o sangre. Los cromosomas de una sola célula a partir de ya sea un celular recién aisladas primaria o una línea celular se extienden sobre un portaobjetos de vidrio. Esta propagación cromosoma está etiquetado con una combinación diferente de tintes fluorescentes específicas para cada cromosoma. Para la detección de la sonda y la adquisición de imágenes, el sistema de imagen espectral consta de interferómetro de Sagnac y una cámara CCD. Esto permite la medición del espectro de luz visible emitida desde la muestra y para adquirir una imagen espectral vaivénm individuales cromosomas. HiSKY, el software utilizado para analizar los resultados de las imágenes capturadas, proporciona una fácil identificación de anomalías cromosómicas. El resultado final es una metafase y una imagen de clasificación cariotipo, en el que cada par de cromosomas tiene un color distinto (Figura 2). Esto permite una fácil identificación de las identidades cromosoma y translocaciones. Para más información, visite el sitio web Aplicada Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY se utilizó recientemente para la identificación de los defectos de la segregación cromosómica y las anomalías cromosómicas en humanos y ratones con autosómica dominante renal poliquística (PQRAD), una enfermedad genética que se caracteriza por una disfunción en los cilios primarios ^11-13. Usando esta técnica, hemos demostrado la presencia de la segregación cromosómica anormal y anomalías cromosómicas en pacientes PQRAD y modelos de ratón ¹⁴. Los análisis adicionales utilizando SKY no sólo nos permitió identificar el número cromosómico y la identidad, sino también para detectar con precisión las aberraciones cromosómicas muy complejas, tales como deleciones y translocaciones cromosómicas (Figura 2).

Protocolo

1. De la célula pre-tratamiento y preparación de la metafase

1. Las células se cultivan en modif Dulbecco de Medio Eagle (DMEM) que contiene 10-15% de suero fetal bovino (SFB) y 1% penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO ₂ incubadora, hasta que alcanzan 70-80% de confluencia.
2. Se tratan las células con solución colcemid a 0,05 ug / ml para 30-60 min.
3. Se recoge el medio que contiene las células flotantes en 50 ml tubos de centrífuga estériles de halcón. Lavar las células en el plato con sterile1X-PBS. Después de incubar con tripsina estéril para 1-2 min, se cosecha y recoger las células restantes en el mismo tubo.
4. Haga girar los tubos a 1000 rpm durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante dejando 0,5 ml y afloje de pellets con un movimiento rápido con el dedo solamente.
5. Dependiendo del tamaño de pellets, añadir 5-10 ml de solución hipotónica de 0,56% de KCl en dH ₂ O y incubar la suspensión a 37 ° C durante 30-45 min.
6. Agregue una gota de metanol / ácido acético(3:1 vol / vol) por ml de suspensión celular hipotónica e invierta el tubo suavemente para mezclar.
7. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos y recoger el pellet como paso 1.4, a continuación, añadir 5 ml de metanol fresco / ácido acético (3:1 vol / vol) gota a gota la solución de fijación mientras se ojean la pastilla continuamente. Este procedimiento es fundamental para que los spreads metafase no será atrapado en macizos de las células que pondrían en peligro el experimento.
8. Centrifugar de nuevo a 1200 rpm durante 5 min y añadir 5-10 ml de helado de metanol / fijador ácido acético a lo largo de la pared del tubo. En esta etapa, si es necesario, las células pueden ser almacenadas en solución fijadora en un tubo apretados y selladas a -20 ° C durante corto plazo o -80 ° C durante largo plazo (años) para su uso futuro.
9. Diapositivas Limpieza en etanol absoluto, y luego sumerja la diapositiva en dH ₂ O para approximately10X el fin de formar una vaina de agua en la superficie de la diapositiva. Colocar el portaobjetos en una placa de vidrio y la caída del 15-20ul de la suspensión celular (del paso 1.8) De 10 "por encima de la diapositiva. Colocar el portaobjetos en un baño de agua a 65-70 ° C durante 1-2 minutos y dejar secar.
10. Compruebe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con objetivos secos de 10X y 40X asegurándose de que no hay metafase los cromosomas y los diferenciales de los se espacian uniformemente. Comprobación de la existencia citoplasma que rodea a los cromosomas. Si citoplasma está presente proceder con el pretratamiento de diapositivas (digestión con pepsina), si no hay citoplasma está presente y los cromosomas tienen buena morfología, entonces no hay necesidad de pretratamiento de diapositivas.

2. Deslice el tratamiento previo (pepsina tratamiento)

1. Aplicar 120 l de solución 1:200 RNasa (20 mg / ml) disuelto en 2X-SSC en un 24 mm x 60 mm cubreobjetos microscopio e invierta la cara diapositiva metafase abajo en el cubre objetos a continuación, invierta suavemente la cara diapositiva metafase hasta e incubar a 37 ° C durante 45 min.
2. Retire con cuidado el cubreobjetos sin rayar el portaobjetos y lávelo en 2X SSC-tampón en un vaso de Coplin cada 5 minutos durante 15 minutoscon agitación.
3. Añadir 5-15 l de solución stock de pepsina (100 mg / ml en dH ₂ O) en un vaso de precipitados limpio y luego agregar 100 ml de precalentado (37 ° C) 0,01 M de HCl. Es importante que la pepsina se añade en una limpia vaso de precipitados de primera y no directamente en la solución de HCl, de lo contrario no sería disolver en solución. Incubar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene la solución de HCl / pepsina a 37 ° C durante 3-5 min. Este paso es muy crítico como la digestión demasiado causará que los cromosomas que se overdigested y demasiado digestión poco va a dejar el citoplasma sin digerir que podría conducir a la unión no específica de la sonda e interferir con la señal de hibridación.
4. Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml de 1X-PBS durante 5 minutos dos veces a temperatura ambiente.
5. Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml 1X-PBS/MgCl ₂ durante 5 min a temperatura ambiente (50 ml de 1M MgCl ₂ en 950 ml de 1X-PBS).
6. Colocar el portaobjetos en una jarra de Coplin containing 100 ml de 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente (1,7 ml de 37% de formaldehído en 100 ml de 1X-PBS/MgCl _2).
7. Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml de 1X-PBS durante 5 min.
8. Observe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con lente de 40X en seco para asegurar que las diapositivas se digieren correctamente y sin citoplasma está presente y la morfología de los cromosomas se conserva. Seleccione un área para la hibridación con una pluma de diamantes.

3. Cromosoma y la sonda desnaturalización y la hibridación

1. Prepare una solución fresca de desnaturalización (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) y precalentamiento a 70-80 ° C en un vaso de Coplin colocado en un Lugar baño de agua la diapositiva en el vaso de Coplin que contiene la solución desnaturalizante en un baño de agua a 70 ° C durante cromosomas de ratón y 80 ° C durante cromosomas humanos para 30s-1.5 min.
2. Coloque inmediatamente la diapositiva en el hielo-frío etanol 70% durante 3 min seguido por 80% y 100% de etanol durante 3 min cada uno y aire seco. Examinar el portaobjetospara la morfología cromosoma. Morfología de los cromosomas Bueno se denota por los cromosomas oscuros y no "de luz de fase" o halo cromosomas.
3. Caliente la sonda SkyPaint (kit de SKY pintura; vial de # 1) a 37 ° C con agitación durante 20 min, vórtice y centrifugar brevemente a 1000 rpm durante unos pocos segundos.
4. Desnaturalizar la sonda en un termociclador programado para un ciclo de dos-paso a 85 ° C para el ciclo de 5 min seguido de 37 ° C durante 60 min para permitir etiquetados-sonda de ADN para preannealing.
5. Aplicar 10ul de la sonda desnaturalizada en el área de la hibridación y la tapa con una de 22 mm x 40 mm cubreobjetos con cuidado de no atrapar burbujas de aire. Selle los bordes del cubreobjetos con cemento de goma y se incuban en una cámara húmeda a 37 ° C durante 48-72 horas.

4. La detección de sondas fluorescentes

1. Retire el cubreobjetos con cuidado y coloque el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene precalentado (45 ° C) la solución de lavado I (formamida 50% recién preparada en 2X SSC). Lavar durante 5 minutosrealizada tres veces a 45 ° C en un baño de agua con agitación a 45 rpm
2. Lavar el portaobjetos en solución de lavado II (1X SSC) a 45 ° C durante 5 min dos veces con agitación.
3. Lave la diapositiva en el lavado de solución III (4X SSC/0.1% de Tween 20) durante 5 min a 45 ° C con agitación.
4. Aplique 80 l de reactivo de bloqueo (kit de pintura SKY; vial n º 2), coloque un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
5. Retire la corredera y permitir que el líquido drene. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5 (concentrado de anticuerpos de detección de CAD kit, vial n º 3), aplique un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 40 min.
6. Lavar el portaobjetos con solución de lavado III en 45 ° C durante 5 min tres veces con agitación.
7. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5.5 (concentrado de anticuerpos de detección de CAD kit, vial n º 4), coloque un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 40 min.
8. Lavar el portaobjetos con solución de lavado III en 45 ° C durante 5 min tres veces con agitación.
9. Incline la diapositiva y permitir que el líquido escurrir. Aplique 20 l del reactivo anti-fade DAPI (kit de pintura SKY; vial n º 5) y colocar una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos microscopio. Retire con cuidado las burbujas de aire que puedan haberse formado. Diapositivas pueden ser reflejados inmediatamente o almacenadas a 4 ° C en la oscuridad durante no más de 1 semana.

5. Imagen de adquisición y análisis

1. La adquisición de imágenes se logra mediante la visualización diapositivas metafase utilizando un microscopio Olympus equipado con una lente de aceite de inmersión 60X, un cubo espectral (personalizado diseñado triples banda filtro de paso), un filtro de DAPI y un módulo de Sagnac interferómetro con una cámara CCD.
2. Espectral de los cariotipos se llevaron a cabo utilizando el software SKY Vista (versión aplicada de imágenes espectrales 1,62) siguiendo el manual del usuario.
3. Después de analizar las imágenes, los cromosomas pueden ser vistos como imágenes en color (con determinados colores fluorescentes), imágenes de pseudo color (con los colores para la clasificación) y las imágenes invertidas DAPI (patrón específico de bandas).

e_title "> 6. Los resultados representativos

Un procedimiento de SKY completa generalmente toma alrededor de una vez por semana (Figura 1). Esto incluye la adquisición de imágenes y el análisis siempre que las células en metafase están en cantidad adecuada. Análisis de cariotipo revela cariotipo normal de ratón (40, XY) de las células de los ratones de tipo salvaje (Figura 2a). En contraste, las células de PKD1 ^{- / -} ratón (modelo DCP ratón) muestra un aumento significativo en el número de cromosomas y las anormalidades estructurales, tales como deleciones del cromosoma (el cromosoma # 8) y translocaciones (los cromosomas 11 y 19) (Figura 2b). También se analizaron los tejidos vasculares de los pacientes PQRAD. Un estudio simple contando los números cromosómicos indicó que no PQRAD y algunas muestras vasculares PQRAD tenía normales números cromosómicos de 23 pares (figura 2c). En general, sin embargo, se observó fracaso de la segregación cromosómica, lo que resulta en 46 pares de cromosomas en AMuestras DPKD en lugar de pares 23 (Figura 2d).

Figura 1. Diagrama de flujo de SKY protocolo. Diagrama de flujo del protocolo de SKY ilustra los pasos para completar un experimento a partir de células pre-tratamiento y preparaciones en metafase a la adquisición y análisis de imágenes. Un aproximado de una semana calendario se presenta a la izquierda con los procedimientos paso a paso para cada día.

Figura 2. Cariotipo espectral en inmortalizado líneas celulares de ratón y células primarias recién aisladas de humanos. El color y las imágenes invertidas DAPI de los cromosomas individuales se muestran antes de la clasificación de los cromosomas. Después de la clasificación, los cromosomas se presentan en la "clasificación" de mesa. Una imagen del cielo) de una extensión metafase de ratón de tipo salvaje contiene un cariotipo normal (40, XY). B) SKY imagen de una propagación de la metafase PKD1 ^{- / -.} del ratón muestra el número de cromosomas anormales (68 en lugar de 40) y las anomalías cromosómicas, como deleciones del cromosoma (el cromosoma 8) y translocaciones cromosómicas (cromosomas 11 y 19) c) SKY imagen de una propagación metafase del tejido vascular de un paciente no tiene PQRAD cariotipo normal (46, XX). d) imagen del cielo de una propagación de la metafase el tejido vascular de un paciente con PQRAD contiene cariotipo anormal (92, XXXX). Partes de los datos han sido previamente informado y se reutiliza con permiso ^14.

Discusión

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética utilizada en el estudio de las composiciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, y la detección de estas sondas son adquiridos a través de un interferómetro de Sagnac. El proceso de SKY completa generalmente toma alrededor de una semana, e implica varios pasos clave (Figura 1). El SKY utiliza un protocolo estándar, el cual fue descrito por primera vez por Padilla-Nash et al <...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Cellgro Mediatech Inc.	10 a 013 CV
De suero fetal bovino (SFB)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin / estreptomicina	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 g / ml
De HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Fosfato solución salina tamponada	Thermo Scientific	SH30256-01
SKY pintura Sonda (Humana)	Imágenes Applied Spectral	SKY000028
SKY pintura Probe Kit (Mouse)	Imágenes Applied Spectral	SKY000030
Concentrado kit de detección de anticuerpos	Imágenes Applied Spectral	SKY000033
Tripsina	Thermo Scientific	SH30236.01
El metanol	Fisher Scientific	A433P-4
El ácido acético	Fisher Scientific	A38-212
RNasa A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsina	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl 2	Fluka	63069-500ML
37% El formaldehído	Mallinckrodt Baker	2106-02
SSC 20X	Promega	V4261
Formamida	Fluka	47671	preparar justo antes de usarse
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-549
Microscopio cubierta de vidrio 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Adhesivo de goma	Elmer (tienda local)
Hibridación / humidifiedchamber / bandeja	Simport	M920-2	poner las toallas de papel mojadas en la parte inferior
Thermociclista	Eppendorf	Epgradient S
Plataforma de agitación / Agitador orbital	Bellco Biotecnología
Baño de agitación / agua	Precisión Científico
DAPI filtro de cubo	Chroma Technology
SKY filtro de cubo	Chroma Technology
SpectraCube	Imágenes Applied Spectral
Celular microscopio invertido la cultura	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	IX70	Aceite de 60X