多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

要約

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体異常を識別するための高度な細胞遺伝学的手法です。この手法は、すべての染色体の分類を可能にする染色体ペインティングプローブ、を利用しています。 SKYはまた、多発性嚢胞腎疾患を含む様々な疾患を持つマウスとヒトの複雑な染色体異常や偏析欠陥を識別することができます。

要約

識別し、個々の染色体を分類する従来の方法は^、1、2を分析^している特定の種の各染色体のユニークなバンドパターンに依存しています。この古典的なバンディング技術は、しかし、そのような癌に関連付けられているような複雑な染色体異常を識別するのに信頼できるものではありません。バンディング技術の限界を克服するために、スペクトル核型分析（SKY）は、染色体異常に多くの信頼できる情報を提供するために導入されています。

SKYは、スペクトル顕微鏡^3、4と中期染色体を検出するために多色蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）テクニックです。 SKYは、遺伝的疾患や悪性腫瘍^5、6の大規模な番号に関連付けられている染色体異常の広い範囲の細胞遺伝学的分析のための貴重なツールであることが実証されています。 SKYは、縮退oligonucleから調製された多色蛍光標識DNAプローブの使用を含むPCR法によるotideプライマー。したがって、すべての染色体は差蛍光染料（ローダミン、テキサスレッド、Cy5で、FITC及びCy5.5）の混合物で標識されたプローブとのin situハイブリダイゼーション後のユニークなスペクトル色を持っています。 SKYに使用されるプローブは^、7月10日 55染色体特異的プローブまでで構成されています。

SKYの手順は、いくつかの手順を実行します（ 図1）が含まれます。 SKYは、正常または病気の組織や血液から高い分裂指数と細胞の可用性を必要とします。新たに単離した初代培養細胞または細胞株のいずれかから単一細胞の染色体は、ガラススライド上に広がっています。この染色体の広がりは、各染色体の特定の蛍光色素の異なる組み合わせで標識されている。プローブ検出と画像取得のために、スペクトルイメージングシステムは、サニャック干渉計とCCDカメラで構成されています。これは、サンプルから発せられる可視光スペクトルの測定を可能にし、あちこちスペクトル画像を取得するメートル、個々の染色体。 HiSKY、撮影した画像の結果を分析するために使用されるソフトウェアは、染色体異常の簡単な識別を提供しています。最終結果は、中期染色体の各ペアは、異なる色（ 図2）を有する核型分類のイメージです。これは染色体のアイデンティティと転座を簡単に識別することができます。詳細については、適用されるスペクトルイメージングのWebサイト（参照してくださいhttp://www.spectral-imaging.com/ ）。

SKYは、最近、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）、一次繊毛^11-13の機能不全を特徴とする遺伝性疾患とヒトとマウスの染色体の分離の欠陥と染色体異常の同定に使用されていました。このテクニックを使用して、我々は異常な染色体の分離とADPKD患者およびマウスモデル¹⁴の染色体の欠陥の存在を実証。 SKYを使用して更なる分析は、私たちは、染色体数とIDを識別するためだけでなく、正確にそのような染色体欠失と転（ 図2）のような非常に複雑な染色体異常を検出することはできませんだけ。

プロトコル

1。細胞の前処理と中期の準備

1. 彼らは70から80パーセントがコンフルエントに達するまで細胞は、5％CO ₂インキュベーターで37で10〜15％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン°Cを含むイーグル培地（DMEM）のダルベッコの改変で栽培されています。
2. 30〜60分間は0.05μg/ mlのコルセミド溶液で細胞を処理します。
3. 50 mlの滅菌ファルコン遠心チューブ内の任意の浮遊細胞を含む培地を収集します。 sterile1X-PBSでプレート上で細胞を洗浄します。 1〜2分間滅菌したトリプシンでインキュベートした後、収穫し、同じチューブに残りの細胞を収集します。
4. 5分間1000rpmでチューブを回転させ、上清を残して0.5 mlを吸引し、唯一の指でフリックでペレットを緩めます。
5. ペレットのサイズに応じて、dH ₂ Oでの0.56％のKClの低張液の5〜10 mlを追加し、30から45分間37℃で懸濁液をインキュベートします。
6. メタノール/酢酸の一滴を追加します。（3:1​​ vol / vol）のml当たり低張性の細胞懸濁液と混合するために穏やかにチューブを反転させる。
7. 継続的にペレットをフリックしながら5分間1200rpmで遠心分離し、ステップ1.4としてペレットを収集し、新鮮なメタノール/酢酸（3:1 vol / vol）の固定液を滴下し、5 mlを加える。この手順では、中期スプレッドは実験が損なわれる細胞の塊の中に閉じ込めされないようにすることが重要です。
8. 5分間1200rpmで再び遠心し、チューブの壁に沿って氷冷メタノール/酢酸固定液の5〜10 mlを加える。必要に応じて、この段階で、細胞は短期または-80 -20°Cで締めて密封チューブ内に固定液に保存することができます°C今後の使用のために長期（年）。
9. 無水エタノールできれいにスライドし、スライドの表面に水の鞘を形成するためにapproximately10XためのdH ₂ Oでスライドを浸す。 （ステップ1.8からの細胞懸濁液をガラス板とドロップ15-20μlの上でスライドを配置する） "10からスライドの上に1-2分間65から70に設定され水浴°Cでスライドを置き、乾燥させます。
10. 中期染色体スプレッドは等間隔があることを確認すること10Xと40Xの乾燥の目標を使用して光学顕微鏡下でスライドを確認してください。染色体を周囲の細胞質の存在を確認してください。細胞質は、現在のスライドの前処理（ペプシン消化）を続行している場合には細胞質が存在しないと染色体は、優れた形態を持っている場合は、スライドの前処理の必要はありません。

2。スライドの前処理（ペプシン処理）

1. 24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスに2X-SSCに溶解し、1:200のRNase溶液（20 mg / ml）を120μLを適用し、優しく中期スライド面を反転してインキュベートし、カバーガラス上で中期のスライドを下向きに反転させる37℃で45分間。
2. 慎重にスライドを傷つけず​​にカバーガラスを除去し、コプリンジャーに2X-SSC緩衝液中で15分間毎に5分を洗う振とう。
3. きれいなビーカーにペプシン原液の5〜15μL（dH ₂ Oで100 mg / ml）を追加して、あらかじめ温めておいた100mlの追加（を37°C）0.01M HClを。 これは、ペプシンがクリーンに追加されることが重要です。直接HCl溶液に最初のではなく、ビーカー、それ以外の場合は、溶液に溶解しませんでした。で37塩酸/ペプシン溶液の入ったコプリンジャーにスライドをインキュベートし、3〜5分間°C。あまりにも多くの消化が染色体がoverdigestedされるようになりますし、少なすぎると消化は、プローブの非特異的な結合につながるとのハイブリダイゼーションシグナルに干渉する可能性のある細胞質消化のままになり、このステップは非常に重要です。
4. 室温で二回、5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
5. 室温で5分間（1X-PBS 950 mlの1M MgCl ₂の50ミリリットル）が100ミリリットル1X-PBS/MgCl _2を含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
6. コプリンジャーcontaininのスライドを配置する室温（1X-PBS/MgCl ₂の100ミリリットルの37％ホルムアルデヒドの1.7 ml）をgで10分間100ミリリットル、1％ホルムアルデヒド。
7. 5分間100ミリリットル1X-PBSを含むコプリンジャーにスライドを洗浄します。
8. スライドが適切に消化されず、細胞質が存在しないと染色体の形態が保持されていることを確認する40X乾燥したレンズを使用して光学顕微鏡下でスライドを観察します。ダイヤモンドペンを用いたハイブリダイゼーションの領域を選択します。

3。染色体とプローブの変性とハイブリダイゼーション

1. 新鮮な変性溶液（70％formamide/2X SSC、pH7.0）で70〜80にprewarm℃〜70℃の水浴で変性溶液を含むコプリンジャーにスライド水浴場所に置かれコプリンジャーに°を準備します。マウスの染色体と80°C、C 30-1.5分間のヒト染色体のために。
2. 直ちに3 80％と続いminと3分ごとに、空気乾燥した100％のエタノール、氷冷70％エタノールでスライドを配置します。スライドを調べる染色体の形態のために。優れた染色体の形態は、暗い染色体とされていません "相光"またはハロ染色体によって表されます。
3. 数秒間、1000rpmで簡単に20分、ボルテックスと遠心分離のために振とうしながら37℃で、SkyPaintプローブ（バイアル1位SKY塗装キット）を温める。
4. preannealingのために標識プローブDNAを許可するように60分間37°Cに続いて5分サイクルの85℃で2段階のサイクルのためにプログラムサーモプローブを変性させる。
5. 22ミリメートル×40 mmのカバーガラスには気泡をトラップしないようにして作るとのハイブリダイゼーションとカバーの領域に変性したプローブを10μlの適用されます。 48から72時間37℃で加湿チャンバーのゴムセメントとインキュベートするとカバーガラスの端をシールします。

4。蛍光プローブの検出

1. 慎重にカバーガラスを除去し、（45°C）、洗浄液I（2×SSCで新たに調製し、50％ホルムアミド）予熱を含むコプリンジャーにスライドを配置します。 5分間洗浄45三回45回転で振とう水浴中°C
2. 振とうしながら45回溶液II（1X SSC）℃で5分間の洗浄でスライドを洗浄します。
3. 45℃で5分間解IIIを（4X SSC/0.1％Tween 20）で洗浄℃の振とうしながらスライドを洗浄します。
4. ブロッキング試薬80μlの（SKYのペイントキット、バイアル＃2）を適用し、30分間37℃でカバースリップとインキュベートを配置します。
5. スライドを削除し、流体が流出することができます。 Cy5で染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃3）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを適用します。
6. 振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。
7. Cy5.5染色試薬（濃縮抗体検出CADキット、バイアル＃4）80μlを適用し、40分間37℃でカバーガラスとインキュベートを配置します。
8. 振とうしながら5分間45°Cで3回ソリューションIIIを洗浄してスライドを洗浄します。
9. スライドを傾けて、流体を許可ドレイン。アンチフェード試薬DAPI（SKYのペイントキット、バイアル＃5）の20μlを適用し、24ミリメートル×60 mmの顕微鏡のカバーガラスを配置します。慎重に形成されているかもしれない空気の泡を削除します。スライドはすぐに撮影さまたは4℃で保存し1週間を超えないために暗闇の中でCすることができます。

5。画像収集と分析

1. 画像の取得は60X油浸レンズを搭載したオリンパス顕微鏡、スペクトルキューブ（カスタム設計されたトリプルバンドパスフィルタ）、DAPIフィルターとCCDカメラによるサニャック干渉計モジュールを使用して、中期のスライドを表示することによって達成されます。
2. スペクトル核型は、ユーザーズマニュアルは、次のスカイビュー·ソフトウェア（応用分光イメージングバージョン1.62）を用いて行った。
3. 画像を分析した後、染色体はカラー画像（特定の蛍光色を含む）、擬似カラー画像（分類のための色）と反転DAPI画像（特定のバンディングパターン）と見なすことができます。

e_title "> 6。代表的な結果

完全SKY手順は、通常1週間程度の時間（ 図1）をとります 。これは、中期細胞が十分に供給されていることを提供された画像の取得と分析が含まれています。核型分析では、野生型マウス（ 図2a）からの細胞の正常なマウスの核型（40、XY）を明らかにする。対照的に、PKD1から細胞^{- / -}マウス（PKDモデルマウス）染色体数や染色体欠失（染色体＃8）と転座（染色体＃11と19）（ 図2b）のような構造異常の有意な増加を示しています。また、ADPKD患者から血管組織を分析した。染色体の数を数えることによって、単純な研究では、非ADPKDといくつかのADPKD血管のサンプルは23対の染色体の正常な数値（ 図2c）を有していたことが示された。しかし、一般的に、我々は、染色体の46ペアで、その結果、染色体分離の障害を観察したDPKDサンプルの代わりに23対（ 図2d）。

図1。 SKYプロトコルのフローチャート。SKYプロトコルは細胞の前処理と中期の準備からの画像取得と解析を開始する実験を完了する手順を示しています。のフローチャートおおよそ一週間のタイムラインは日ごとにステップバイステップの手順で左側に提示されます。

図2。不死化マウス細胞株と新たに単離されたヒト初代培養細胞のスペクトル核型分析。個々の染色体の色と反転DAPI画像は染色体のソートの前に示されています。並べ替えの後、染色体は"分類"テーブルに表示されます。）は、野生型マウスからの中期スプレッドのSKYイメージが正常核型（40、XY）が含まれています。B） PKD1から中期スプレッドの>空画像^{- / -}マウスは、異常な染色体数（68の代わりに40）、このような染色体欠失（染色体＃8）と染色体転座（染色体＃11と19）のような染色体異常を示しています。C）SKY非ADPKD患者の血管組織からの中期スプレッドのイメージは、正常な核型（46、XX）を備えています。d）は ADPKD患者の血管組織から広がる中期の空のイメージは、異常な核型（92、XXXX）が含まれています。データの一部は、以前報告され、許可¹⁴で再利用されています。

ディスカッション

スペクトル核型分析（SKY）は、ゲノムと染色体の組成を研究に使用される細胞遺伝学手法です。この手法では、染色体彩色プローブを活用し、これらのプローブの検出は、サニャック干渉計を介して取得されます。完全SKYプロセスは、通常1週間程度かかり、それはいくつかの重要なステップ（ 図1）が含まれます。 SKYは、最初のパディリャ、ナッシュら ³によって...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Cellgroメディアテック株式会社	10から013-CV
ウシ胎児血清（FBS）	ハイクローン	SH30088-03
Penecillin /ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SV30010
コルセミド	ロシュ·ダイアグノスティックス	10 295 892 001	10μg/ mlの
塩酸	フィッシャー·サイエンティフィック	A144-500
塩化カリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	S77375-1
リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH30256-01
SKYペイントプローブキット（ヒト）	適用されたスペクトルイメージング	SKY000028
SKYペイントプローブキット（マウス）	適用されたスペクトルイメージング	SKY000030
濃縮された抗体検出キット	適用されたスペクトルイメージング	SKY000033
トリプシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH30236.01
メタノール	フィッシャー·サイエンティフィック	A433P-4
酢酸	フィッシャー·サイエンティフィック	A38-212
RNaseの	ロシュ·ダイアグノスティックス	10 109 169 001
ペプシン	Sigma-Aldrich社	P6887-5G
MgCl 2を	フルカ	63069-500ML
37％ホルムアルデヒド	マリンクロット·ベーカー	2106から02
20X SSC	プロメガ	V4261
ホルムアミド	フルカ	47671	使用直前に準備する
Tween-20を	フィッシャー·サイエンティフィック	BP337-500
顕微鏡のスライドガラス	フィッシャー·サイエンティフィック	12から549
顕微鏡のカバーガラス24x60mm	VWRビスタビジョン	16004-312
ゴムのり	エルマーの（ローカル小売店）
ハイブリダイゼーション/ humidifiedchamber /トレイ	Simport	M920-2	下部の湿紙タオルを置く
サーモサイクラー	エッペンドルフ	Epgradient S
プラットフォーム/オービタルシェーカーを振る	Bellcoバイオテクノロジー
揺れ/水浴	精密科学
DAPIフィルターキューブ	クロマテクノロジー
SKYフィルターキューブ	クロマテクノロジー
SpectraCube	適用されたスペクトルイメージング
反転した細胞培養顕微鏡	ニコン	ニコンのEclipse TS100
蛍光顕微鏡	オリンポス	IX70	60X油