Polikistik Böbrek Hastalığı Olan İnsanlar ve Fareler kromozom anomalileri Eğitim Spektral Karyotipik

Özet

Spektral Karyotipik (SKY), genomik ve kromozomal sapmaları belirlemek için gelişmiş bir sitogenetik bir yöntemdir. Bu teknik, bütün kromozomlar sınıflamasına izin verir, kromozom boyayan problar yararlanır. SKY da polikistik böbrek hastalığı dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar, farelerde ve insanlarda kompleks kromozom anomalileri ve ayrımcılığın kusurları tespit edebilir.

Özet

Bilgileri kimliğinizi saptamak ve bireysel chromosomes sınıflandırmak için Konvansiyonel bir yöntemini,,,, ^{1, 2,} ediliyor analiz, bir belirli bir türlerin in her biri chromosome of de benzersiz bir bir bantlama bir pattern on bağlıdır. Bu klasik bantlama tekniği Ancak, kanseri ile ilişkili gibi kompleks kromozomal sapmaları belirlenmesinde güvenilir değildir. , Bantlama tekniği sınırlamaları aşmak için, Tayfsal Karyotipik (SKY) kromozom anomalileri kadar güvenilir bilgi sağlamak amacıyla getirilmiştir.

SKY bir çok renkli floresans in-situ hibridizasyon (FISH) tekniği ile metafaz kromozom spektral mikroskop ^{3, 4} algılamak için. SKY geniş bir alanda çok sayıda genetik hastalıklar ve maligniteler ^{5, 6} ile ilişkili kromozom anomalileri sitogenetik analiz için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. SKY, dejenere oligonucle hazırlanan çok renkli floresan işaretli DNA probları kullanımını gerektirirPCR ile otide primerler. Böylece her kromozom farklı floresan boyalar (rodamin, Texas Kırmızı, Cy5, FITC ve Cy5.5) oluşan bir karışım ile etiketlenir probları, in-situ hibridizasyon sonra benzersiz bir spektral renk vardır. SKY için kullanılan sondalar ^7-10 55 kromozom spesifik problar oluşur.

, SKY için yordamı,, birkaç adımları uygulayın (Şekil 1,.) Içerir. SKY yüksek mitotik indeks ile normal ya da hastalıklı doku ya da kan hücrelerinin durumu gerektirir. Taze izole edilen primer hücre veya bir hücre satır ya tek bir hücrenin kromozomlarının bir cam slayt yayılır. Bu kromozom yayılması, her bir kromozom için özel floresan boyalar farklı bir kombinasyonu ile etiketlenmiştir. Sensör algılama ve görüntü alımı için, spektral görüntüleme sistemi sagnac interferometre ve bir CCD kamera oluşur. Bu örnek yayılan görünür ışık spektrumunun ölçümünü sağlar fro spektral görüntü elde etmek içinm bireysel kromozomlar. HiSKY, çekilen fotoğrafların sonuçları analiz etmek için kullanılan yazılım, kromozom anomalilerinin kolay bir kimlik sağlar. Sonuçta bir metafaz ve karyotip sınıflandırma görüntü, kromozomların her bir çifti ayrı bir renk (Şekil 2) sahip olduğu bir. Bu kromozom kimlikler ve translokasyonların kolaylıkla saptanabilmektedir. Daha fazla bilgi için lütfen Uygulamalı Spektral Görüntüleme web sitesi (ziyaret http://www.spectral-imaging.com/ ).

SKY son zamanlarda kromozom ayrımı kusurlar ve kromozom anomalileri Otozomal Dominant Polikistik Böbrek Hastalığı (bireylerinde),, birincil siliya ^11-13 disfonksiyon ile karakterize genetik bir hastalık olan insanlar ve fareler üzerinde yapılan bir tanımlama kullanıldı. Bu tekniği kullanarak, biz, bireylerinde hasta ve fare modelleri ¹⁴ anormal kromozom segregasyon kromozomal anomali ve varlığını göstermiştir. SKY kullanarak daha fazla analizler bize kromozom sayısı ve kimliğini belirlemek için değil, aynı zamanda doğru gibi, kromozom delesyonlarına ve translokasyonlar (Şekil 2) gibi çok karmaşık kromozomal sapmaları tespit etmek için izin verilmez.

Protokol

1. Hücre Tedavi öncesi ve metafaz hazırlığı

1. % 70-80 konfluense ulaşıncaya kadar hücrelerin,, Dulbecco% 5 CO ₂ kuvöz ile% 10-15, 37 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ° C içeren Eagle Orta (DMEM) Modifikasyonunda yetiştirilmektedir.
2. , At 0,05 ug / 30-60 min için ml ', colcemid bir çözüm ile birlikte hücreleri Treat.
3. ,,, 50-ml steril bir-falcon centrifuge tüpler in herhangi bir kayan bir hücreleri ihtiva eden medium Collect. ,, Sterile1X-PBS ile birlikte edilen plaka on hücreleri durulayın. 1-2 dakika, hasat ve aynı tüpe kalan hücreleri toplamak için steril tripsin ile kuluçkaya sonra.
4. Tüpler 1000 rpm'de 5 dakika çevirin,, süpernatan bırakarak 0,5 ml çekilerek sadece parmağınızla hafifçe vurarak pelet gevşetin.
5. Pelet boyutuna bağlı olarak, dH ₂ O% 0.56 KCl hipotonik çözüm 5-10 ml ekleyin ve süspansiyon 37 ° C'de 30-45 dakika inkübe edin.
6. ,,, Metanol /, asetik asit of birini drop Ekle Yeni(3:1 hacim / hacim) ml başına hipotonik hücre süspansiyonu ve karıştırmak için hafifçe ters düz.
7. Sürekli olarak edilmesini takiben pelletin flicking ederken,, 5 min bu için ise rpm 1200 at santrifüjleyin. Ve, bir adım 1,4 gibi pelletini "toplamak..,, Daha sonra, (5),,, taze, metanol /, asetik asit (03:01 vol / vol) fixative bir çözüm damla damla ilave edildi. Of ml 'eklemek. Bu prosedür, metafaz yayılır hücrelerin deney taviz verecek yığınlarda tuzağa olmayacak, böylece kritik önem taşımaktadır.
8. , 5 min Şu aramanız için devir sayısı 1200 rpm için at tekrar santrifüjleyin. Uygulanır ve,,,,, tüp of duvarın boyunca buz-soğuk algınlığı, metanol / asetik asit fixative of 5-10 bir ml 'eklemek.. , Bu evre, ihtiyaç duyulan if At,, hücreleri,,, kısa bir vadeli ya da -80 için, -20 ° C at, bir, sıkılaştırmış ve mühürlenir bir tüp in, fixative çözelti içinde depolanan uygulanmaz edebilirsiniz, ° C, gelecekteki kullanımını için uzun süre bir vadeli (yaş arası) için konulacaktır.
9. , Reaksiyonu mutlak etanol in Temizlik slaytları,, daha sonra,,,, the slide of yüzey on, su of, bir dış kılıf oluştururlar etmek sipariş in, approximately10X 'için dH'den daha fazla ₂ Ç in' bir slayt, de bandırıyoruz. ,,, Bir hücre süspansiyonu: of, bir cam plate: ve drop: 15,-20μl on bir slayt, yerleştirin (1,8 bir adım itibarenÜstünde kayan) "10. 1-2 dakika boyunca 65-70 ayarlanmış bir su banyosuna ° C slayt yerleştirin ve kurumaya bırakın.
10. Metafaz kromozomlar ve yayılır eşit aralıklı emin 10X ve 40X kuru hedefleri kullanarak ışık mikroskobu altında slayt kontrol edin. Kromozomlar çevreleyen sitoplazma varlığı için kontrol edin. Sitoplazma mevcut slayt ön (pepsin sindirim) ile devam edilirse herhangi bir sitoplazma ve kromozomların varsa, iyi morfoloji, sonra slayt ön için gerek yoktur.

2. Slayt ön (pepsin tedavi)

1. Mikroskop coverglass x 60 mm, 24 mm üzerine 2X-SSC çözünmüş 1:200 RNaz solüsyonu (20 mg / ml) 120 ul uygulayın ve sonra yavaşça, metafaz slayt yüzünü invert coverglass metafaz slayt yüzü aşağı yukarı invert ve inkübe (37) ° C 45 min için.
2. 15 dakika için her 5 dakika dikkatlice slayt çizmeden coverglass kaldırmak ve bir coplin kavanoza 2X-SSC tampon yıkayınsallayarak.
3. ,,,, Bir temiz bir bir beherdeki içine Şu, pepsin hisse senedi bir çözüm of 5-15 mikrolitre ((-100), dH ₂ Ç in mg / ml ') ekle ve, sonra da-100 ml' of Ön ısıtması yapılan, eklemek (. (37). ° C ile) 0.01 M HCl., It pepsin,, bir temiz bir içine da eklendi edilir, olduğunu önemli bir konumundadır HCl çözeltisi içine doğrudan ilk ve beher, aksi takdirde çözüm çözünmesi olmaz. 37 HCl / pepsin çözeltisi içeren, bir coplin kavanoza slayt inkübe ° C 3-5 dk. Bu adım çok sindirim, kromozom overdigested neden olacak ve çok az sindirim prob non-spesifik bağlama yol ve hibridizasyon sinyali ile etkileyebilir sitoplazma hazmedilmemiş bırakın olarak son derece önemlidir.
4. Oda sıcaklığında iki kez 5 dakika boyunca 100 ml 1X PBS içeren bir coplin kavanoz slayt yıkayın.
5. ,,,,, Room sıcaklık (,, (950) 1X-PBS of ml in, 1M MgCl ₂ of 50 ml) at 5 min için-100 ml '1X-PBS/MgCl _2, ihtiva eden, bir coplin jar in the slide yıkayın.
6. Slayt bir coplin kavanoz containin yerleştirin, room sıcaklık (1,7 ml ', of-100 ml': 1X-PBS/MgCl ₂ in, (37)% formaldehyde of) at 10 min için g-100 ml ':,% 1 oranında formaldehyde.
7. 5 dakika boyunca 100 ml 1X PBS içeren bir coplin kavanoz slayt yıkayın.
8. Slaytları düzgün bir şekilde sindirilir olduğunu ve herhangi bir sitoplazma ve morfolojisinin korunur sağlamak için, 40X kuru lens kullanarak ışık mikroskobu altında slayt gözlemleyin. Bir elmas kalem kullanarak hibridizasyon için bir alan seçin.

3. Kromozom ve prob denatürasyon ve hibridizasyon

1. Taze denatüre solüsyonu (% 70 formamide/2X SSC, pH 7.0) ve prewarm 70-80 ° C bir su banyosunda 70 denatüre solüsyon içeren coplin kavanoza slayt bir su banyosunda Place yerleştirilir, bir coplin kavanoza ° hazırlayın fare kromozomlar ve 80 C ° C 30s-1.5 dakika için insan kromozomlar için.
2. ,, Immediately 3 (3 min, her biri ve air dry için) 80% tarafından, izledi bir min ve Oranı% 100 etanol için, buz-soğuk algınlığı% 70 oranında etanol in the slide yerleştirebilirsiniz. Slayt inceleyinmorfolojisinin. İyi morfolojisinin karanlık kromozomlar ve "faz-hafif" ya da halo kromozom tarafından gösterilir.
3. Birkaç saniye için 1000 rpm'de 20 dakika, vorteks ve santrifüj kısaca sallayarak; SkyPaint prob (flakon # 1 SKY boya kiti) 37 ° C'de ısıtılır.
4. ,,,,,,,,, Preannealing için etiketlenmiştir-probe DNA izin vermek etmek 60 min, için, (37) ° C kullanıcısı tarafından izledi 5 min döngüsü için, 85 ° C at,, bir, iki-bir adım bir döngüsü için programlanmışsa, bir termalcycler in probe denatüre.
5. 22 mm ile denatüre prob hibridizasyon ve kapak alanı üzerine 10μl uygulayın x 40 mm coverglass hava kabarcıkları yakalamak için emin değilim. 48-72 saat boyunca 37 ° C'de, kauçuk, çimento ve nemlendirilmiş bir odasında inkübe ile coverglass kenarları kapatılmalıdır.

4. Floresan prob algılama

1. Coverglass dikkatlice çıkarın ve slayt içeren coplin kavanoza yerleştirin önceden ısıtılmış (45 ° C) yıkama solüsyonu (2X SSC taze hazırlanmış% 50 formamit). 5 min için yıkayın45 az üç kez 45 rpm'de titreyen su banyosunda ° C
2. 45 ° C 5 dakika boyunca iki kez sallayarak II çözeltisi (1X SSC) yıkama slayt yıkayın.
3. 45 az 5 dakika boyunca çözüm III (4X SSC/0.1% Tween 20) çamaşır ° C sallayarak slayt yıkayın.
4. Engelleme reaktif 80 ul (SKY boya kiti; flakon # 2) uygulayın, 30 dakika 37 ° C'de lamel ve inkübe yerleştirin.
5. Slayt çıkarın ve sıvı süzülmesini bekleyin. 80 ul, boyama Cy5 reaktifi (Konsantre Antikor Algılama CAD kiti; flakon # 3) uygulayın, 40 dakika 37 ° C'de bir coverglass vorteksleyin ve uygulanır.
6. ,, Sallayarak ile birlikte 5 min için, (, üç) 45 ° C 'at Zamanlar bir çözüm III. Ürüne yıkama ile birlikte the slide yıkayın.
7. 80 ul, boyama Cy5.5 reaktifi (Konsantre Antikor Algılama CAD kiti; flakon # 4) uygulayın, 40 dakika 37 ° C'de bir coverglass ve inkübe yerleştirin.
8. ,, Sallayarak ile birlikte 5 min için, (, üç) 45 ° C 'at Zamanlar bir çözüm III. Ürüne yıkama ile birlikte the slide yıkayın.
9. , The slide Astro Morocross Eğilme ve akışkan etmek izin vermek. süzün. Anti-solmaya DAPI reaktifi (SKY boya kiti; flakon # 5) 20 ul uygulayın ve mikroskop coverglass x 60 mm, 24 mm yerleştirin. Oluşabilecek hava kabarcıkları dikkatlice çıkarın. Slaytlar hemen yansıması veya 4 saklanabilir 1 haftadan daha uzun süre karanlıkta ° C.

5. Resim toplama ve analiz

1. Görüntü alımı 60X immersiyon yağı lens, CCD kamera ile Spektral bir küp (özel olarak tasarlanmış üç bant geçiren filtre), bir DAPI filtre ve bir sagnac interferometre modül ile donatılmış bir mikroskop kullanarak metafaz slaytlar inceleyen tarafından gerçekleştirilir.
2. Spektral-karyotiplerin kullanım kılavuzu SKY View yazılımı (Uygulamalı spektral görüntüleme Sürüm 1.62) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
3. Görüntüleri analiz ettikten sonra, kromozomlar renkli görüntüler (özel floresan renkleri ile), sözde renkli görüntüler (sınıflandırma için renklere sahip) ve ters DAPI görüntüleri (özel bantlama pattern) olarak görülebilir.

E_TITLE "> 6 Temsilcisi Sonuçlar

Tam bir SKY prosedür genellikle yaklaşık bir hafta zaman alır (Şekil 1). Bu görüntü toplama ve analiz metafaz hücreler yeterli kaynağı olduğunu içerir. Karyotipik analiz vahşi tip farelerde (Şekil 2a) hücrelerin normal fare karyotip (40, XY) ortaya koymaktadır. Buna karşılık, Pkd1 hücreleri ^{- / -} fare (PKD fare modeli) kromozom sayısı ve kromozom delesyonlarına (Kromozom # 8) ve translokasyonlar (kromozomlar # 11 ve 19) (Şekil 2b) gibi yapısal anormallikleri, önemli bir artış gösterir. Biz,, aynı zamanda,, ADPKD hastalarda from vasküler dokularda de de olduğunu da analiz. Kromozomal numaraları sayarak basit bir çalışma olmayan bireylerinde ve bazı bireylerinde vasküler örnekleri 23 çift normal kromozom sayıları (Şekil 2c) olduğunu belirtti. Ancak, biz, genel olarak A 46 çift kromozom sonuçlanan, kromozomal ayrımcılığın başarısızlığı gözlenenDPKD örnekleri yerine 23 çift (Şekil 2d).

Şekil 1. SKY protokolü akış şeması. SKY protokol Akış şeması görüntü toplama ve analiz için hücre öncesi ve metafaz preparatları itibaren bir deney tamamlamak için adımları göstermektedir. Yaklaşık bir haftalık zaman çizelgesi, her gün için adım-adım prosedürleri ile soldaki sunulmaktadır.

Şekil 2. Renk ve bireyin kromozomlarının ters DAPI görüntüleri ölümsüzleştirdi fare hücre hatları ve taze izole insan primer hücrelerinde Spektral karyotip kromozomal sıralama önce gösterilmiştir. Sıralama sonra, kromozomlar "sınıflandırma" tabloda gösterilmiştir a) vahşi tip fare bir metafaz yayılmasını SKY görüntü normal karyotip (40, XY) içerir. B) SKY görüntü SKY fare anormal kromozom sayısı (68 yerine 40) ve kromozom delesyonlarına (kromozomu # 8) ve kromozom translokasyonları (kromozomlar # 11 ve 19) gibi kromozom anormallikleri gösterir c) ^{- / -} Pkd1 bir metafaz yayılması bireylerinde olmayan bir hastanın damar dokusu bir metafaz yayılmasını görüntü normal karyotip (46, XX). d) bireylerinde bir hastanın vasküler doku metafaz yayılmasını SKY (92, XXXX) anormal karyotip içerir vardır. , Veri of Parts, daha önceden olarak bildirdin ve, iznine ^{14 'ile} birlikte devşirme edilmiştir adres.

Tartışmalar

Tayfsal Karyotipik (SKY), genomik ve kromozomal kompozisyonlar incelenmesinde kullanılan bir sitogenetik tekniktir. Bu teknik kromozom boyayan problar yararlanır ve bu problar tespiti bir sagnac interferometre yoluyla elde edilir. Tam SKY süreç genellikle bir hafta sürer ve birkaç önemli adımları içermektedir (Şekil 1). SKY ilk Padilla-Nash ve ark. ³ tarafından tanımlanan standart bir protokol kullanır. Protokolü bu yana ülkemiz de dahil olmak üzere çeşitli sitogen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penecillin / Streptomisin	Thermo Scientific	SV30010
Colcemid	Roche Diagnostics	10 295 892 001	10 ug / ml ''
HCl	Fisher Scientific	A144-500
KCl	Fisher Scientific	S77375-1
Fosfat tamponlu salin	Thermo Scientific	: SH30256-01
SKY boya prob kiti (İnsan)	Uygulamalı Spektral Görüntüleme	SKY000028
SKY boya prob kiti (Fare)	Uygulamalı Spektral Görüntüleme	SKY000030
Konsantre antikor tespit kiti	Uygulamalı Spektral Görüntüleme	SKY000033
Tripsin	Thermo Scientific	SH30236.01
Metanol	Fisher Scientific	A433P-4
Asetik asit	Fisher Scientific	A38-212
RNaz A	Roche Diagnostics	10 109 169 001
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G
MgCl 2	Fluka	63069-500ML-
37% Formaldehit	Mallinckrodt Baker	2106-02
20X SSC	Promega	V4261
Formamid	Fluka	47671	kullanmadan önce sadece hazırlamak
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Mikroskop cam slaytlar	Fisher Scientific	12-549
Mikroskop kapağı cam 24x60mm	VWR Vista Vision	16004-312
Kauçuk tutkalı	Elmer (yerel perakende mağazası)
Hibridizasyon / humidifiedchamber / Tepsi	Simport	M920-2	altındaki ıslak kağıt havlu koymak
Thermocycler	Eppendorf	Epgradient S
Platformu Çalkalama / Orbital çalkalayıcı	Bellco Biyoteknoloji
Çalkalama / su banyosu	Hassas Bilimsel
DAPI filtre küp	Krom Teknoloji
Sky filtre küp	Krom Teknoloji
SpectraCube	Uygulamalı Spektral Görüntüleme
Ters hücre kültürü mikroskobu	Nikon	Nikon Eclipse TS100
Fluorescence mikroskop	Olympus	IX70	60X yağ