Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Resumen

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Resumen

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.

Introducción

Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. ¹⁵ N etiquetado ¹ y ² SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT ^3, iTRAQ ^4, y la reducción de dimethylation ⁵ agregan etiquetas de isótopos estables después de la extracción de proteínas y la digestión. Entre estos métodos, dimetilación reductora (etiquetado Redi) está ganando popularidad como un método económico y reproducible para cuantificar las diferencias de concentración de proteína en casi cualquier tipo de muestra.

Etiquetado Redi implica péptidos que reaccionan con el formaldehído para formar una base de Schiff, que se reduce luegode cianoborohidruro. Esta reacción dimethylates grupos amino libres en N-terminales y cadenas laterales de lisina y monomethylates prolinas N-terminales. El protocolo descrito aquí methylates péptidos en la muestra 1 con una etiqueta de "luz" usando reactivos con átomos de hidrógeno en su distribución isotópica natural y la muestra 2 con una etiqueta de "pesado" con formaldehído deuterado y cianoborohidruro (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado en un péptido da como resultado una diferencia de masa de 6,0377 Da entre la luz y las formas pesados, que se emplea para distinguir entre las dos formas utilizando un espectrómetro de masas. Específicamente, las abundancias relativas de péptidos se cuantifican como la relación de áreas cromatograma de iones extraídos MS1 (relación de área de pico MS1) de la luz y la versión pesada para cada par de iones de péptido. La abundancia relativa de una proteína se calcula como la mediana relación de área de pico MS1 entre todos los péptidos en la proteína. En este reporte se describe un protocolo robusto por conductaing experimentos de etiquetado Redi por LC-MS/MS que incluye la extracción de fase inversa de péptidos en fase sólida, etiquetado Redi en columna, fraccionamiento por pH básico péptido en fase inversa (BPRP) cromatografía, y la purificación de mezclas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Se discuten las ventajas y limitaciones del uso de etiquetado Redi para proteómica cuantitativa.

Protocolo

NOTA: Este método fue descrito previamente ^12.

1. De aislamiento de proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por las células de lisis, preferiblemente por métodos físicos como la prensa francesa, golpes de talón, o ultrasonidos. Evitar la lisozima lisis celular mediada porque la enzima confundirá mediciones de espectrometría de masas.

2. Precipitación con TCA de las proteínas

Añadir ácido tricloroacético 1 volumen (TCA) a 4 volúmenes de proteínas y se enfría en hielo durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de acetona enfriada con hielo y se centrifuga a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante e invierta el tubo en el banco para secar el sedimento durante 15 min. Pellets de proteína Almacenar a -80 ° C.

3. Desnaturalizar las proteínas y reducir enlaces disulfuro

Resuspender las proteínas a ~ 2 mg / ml en 500 l de tampón de desnaturalización y reducción (o bien 4 M de urea o SDS al 3% en 50 mM de HEPES, pH 8,5, DTT 5 mM). Opcionalmente, incluir un inhibidor de la proteasa en la memoria intermedia. Incubar las proteínas durante 30 min a 56 ° C, seguido por 10 min a temperatura ambiente.

4. Aklylate gratis Sulfidrilo Grupos de perturbar irreversiblemente disulfuro Formación

Prepare fresco 0,3 M yodoacetamida en agua. ¡CUIDADO! Yodoacetamida es altamente tóxico. Añadir 25 l 0,3 M yodoacetamida (15 mM de concentración final) a 500 l de proteína y se incuba durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Sacia yodoacetamida añadiendo 10 l de 300 mM DTT (5 mM concentración final TDT). Guarde proteínas alquiladas a -80 ° C.

5. La digestión de proteínas

TCA precipitar proteínas (como se describe en el paso 2) y resuspender en 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de urea. Preparar una solución madre de Lisil endoproteinASE (Lys-C) en agua a una concentración de 2 g / l y añadir 5 l de la solución de proteína. Incubar la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Asegúrese de que la concentración final Lys-C es 10 ng / l y la relación proteína-a-LysC (W / W) es 1/50 a 1/200. Resuspender 20 g de tripsina grado de secuenciación en 40 l de 50 mM de ácido acético, añadir 5 l (10 mg de tripsina) a la Lys-C digest, y se incuba durante 6 horas a 37 ° C. Utilice la misma concentración de proteasa y proporciones-proteasa-a proteína para Lys-C tal como se utiliza para la tripsina.

6. De fase inversa de péptidos Extracción

1. Acidificar péptidos mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final de 0,5% (pH ≈ 2). Adjuntar una columna C18 a un colector de extracción. Utilice el caudal más alto posible para todas las etapas, excepto carga y la elución de los péptidos.
2. Columna húmeda con 6 ml de acetonitrilo (ACN). Lavar la columna con 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, a continuación, se equilibre con 6 ml de TFA al 0,1%. No permita que lacolumna para funcionar en seco entre los pasos.
3. Deja de presión de vacío y carga de 500 g de péptidos en la columna a un caudal de aproximadamente 1 ml / min. Una vez que los péptidos se han unido a la columna, de vacío reinicio y se lava con 6 ml de TFA al 0,1%, a continuación con 3 ml de tampón de ácido cítrico (0,09 M de ácido cítrico, 0,23 M de Na ₂ HPO _4, pH 5,5).
   Nota: las cantidades de péptido más altas pueden ser etiquetados, pero la columna C18 capacidad de unión deben ser al menos dos veces mayores que la cantidad de péptido para evitar la pérdida de muestra.

7. En la columna de péptido etiquetado por reductiva dimethylation (REDI Etiquetado)

Realice este paso en una campana química como cianuro de hidrógeno se libera en baja concentración durante el proceso de etiquetado.

1. Preparar 12 ml de "ligeros" y tampones Redi "pesados" para metilar aminas péptido libres. Búfer Redi Luz consta de 0,8% de formaldehído y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio llevar hidrógenos en their distribuciones isotópicas naturales en tampón de ácido cítrico. Búfer Redi pesado consiste en 0,8% de formaldehído deuterado y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio deuterado en tampón ácido cítrico.
2. Incubar columna que contiene péptidos mediante la adición de 10 ml ya sea de luz o de amortiguamiento Redi pesada para las columnas que contienen péptidos a un caudal de 1 ml / min y repetir para asegurar el etiquetado completo. Lavar la columna con 6 ml de TFA al 0,1% y luego con ácido acético 1 ml de 0,5%.
3. Deja de vacío y eluir péptidos marcados primero con 1 ml de 40% de ACN, ácido acético 0,5%, luego con 1 ml de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético utilizando un caudal de aproximadamente 0,5 ml / min. Si lo desea, mida la eficiencia de marcaje de muestras individuales por espectrometría de masas antes de mezclar muestras pesadas y ligeras (véase "Los resultados representativos"). Mezclar 01:01 péptido muestras pesadas y ligeras que llevan la etiqueta de ser cuantificados por espectrometría de masas.

8. Separate Péptido Mezcla por Basic pH Fase Invertida (BPRP) Cromatografía

PH básico cromatografía de fase inversa (BPRP) para separar la mezcla de péptidos en múltiples fracciones, que se analizan de forma independiente por LC-MS/MS para aumentar la cobertura del proteoma.

1. Fraccionar la mezcla de péptidos en una columna C18-HPLC mediante la aplicación de un gradiente de concentración creciente de ACN en 10 mM de bicarbonato de amonio (pH 8). Comience con 5% (v / v) de ACN durante 5 min, aumentar a 35% de ACN en 60 min, y luego a 90% de ACN en 1 min. Conservar la ACN 90% durante 4 min antes de reducir la ACN a 5% para volver a equilibrar la columna para 9 min. Recoger 96 fracciones de igual volumen en una placa de 96 pocillos (A1 a H12). Supervisar el fraccionamiento utilizando un detector UV a 220 nm, mientras que los péptidos se eluyen de la columna (10-70 min durante las condiciones descritas aquí).
2. Se combinan las fracciones de los pozos A1, C1, E1, G1 y (fracción A1), a partir de los pocillos B1, D1, F1, y H1 (fracción B1), de los pozos A2, C2, E2, y G2 (fracción A2) y en consecuencia para la restantes fracciones. Retire la solvent usando una centrífuga de vacío. Péptidos Resuspender de fracciones A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 y B12 en 130 l de 1 M urea/0.5% TFA y purificar usando StageTips como se describe en el paso 9. Tienda fracciones B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 y A12 a -20 º C.

9. Purify péptidos por Stop and Go Extracción (StageTips)

Preparar C18-StageTip ⁷ microcolumnas por el embalaje de 200 puntas de pipeta l con dos C18 discos con un diámetro interno (ID) de 1,07 mm. Poner Consejos Etapa en tubos Eppendorf. Utilice una microcentrífuga para lavar consejos con 130 l de metanol, a continuación, 130 ul 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Equilibre StageTips con 130 l 0,1% de TFA. Transferir la mezcla de péptidos a StageTips y se lava con 130 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l de ácido acético al 0,5%. Eluir péptidos primero con 20 l 40% de ACN, ácido acético 0,5%, a continuación, 20 l 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Combine eluidos unnd seco por filtración al vacío.

10. Microcapilares LC-MS/MS

1. Disolver péptidos en 1-5 l de ácido fórmico al 5%, 5% de ACN a una concentración de aproximadamente 1 g / l. Resolver ~ 1 g péptidos en un 100 micras × 20 cm C18-invertidas columna de HPLC de fase con un gradiente de 6-22% de ACN en ácido fórmico al 0,125% aplicado sobre 75 o 100 min a una velocidad de flujo de ~ 300 Nl / min.
2. Identificar péptidos usando un LTQ Velos Orbitrap ¹² o plataforma similar cromatografía líquida-espectrometría de masas con un espectrómetro de masa que disponga de alta resolución y alta precisión en masa. Operar el espectrómetro de masas en modo dependiente de los datos con una MS de barrido completo (resolución de 60000) adquiridos en el analizador Orbitrap. Generar trampa de iones lineal espectros MS / MS para los 20 más abundantes iones detectados en el espectro MS. Ajuste el control automático de ganancia (AGC) objetivos a 1 x 10 ⁶ para el pleno MS y 2000 para MS / MS. Establecer tiempos máximos de acumulación de iones para 1000 msegpara MS y 150 mseg para MS / MS. Excluir iones precursores de péptidos fragmentados de una selección adicional de MS / MS de 20-60 seg.

11. MS / MS de Adquisición de Datos

Identificar péptidos mediante la comparación de archivos RAW espectros MS / MS a una base de datos teórica con un algoritmo tal como SEQUEST ⁸ usando estos parámetros (Tabla 1).

Tabla 1. Péptido de bases de datos de parámetros de búsqueda.

Parámetros generales	digestión plenamente tríptico con hasta 2 perdió divisiones
	25 ppm de iones de precursor de la tolerancia
	1.0 Da fragmento de la tolerancia de iones
Modificaciones estáticas	57.02146 Da en cisteína, carboxiamidometilación
	28.03130 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation luz
Modificaciones dinámicas	15.99491 Da en metionina, la oxidación
	6.03766 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation pesada

1. Filtrar péptidos a una tasa de falso descubrimiento 1% con un método como la estrategia de objetivo señuelo ⁹ usando una base de datos de los marcos de lectura abiertos en las orientaciones reales e invertidas.

12. Péptido Cuantificación

Calcular las áreas de pares pesadas y ligeras de MS1 extrajeron los cromatogramas de iones (áreas de los picos MS1) y el péptido de señal a ruido (S / N) las relaciones de ^10. Incluya pares peptídicos sólo cuando su media de señal a noirelación en sí está por encima de cinco. Cuantificar la abundancia relativa de un péptido en las dos muestras como la relación de áreas de los picos de MS1 versiones pesadas y ligeras de la misma péptido (proporción de área de pico MS1). Cálculo de las abundancias de proteínas relativos como la relación del área del pico MS1 mediana para todos los péptidos en la proteína.

Resultados

Se evaluó la exactitud, precisión y reproducibilidad de etiquetado Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae y Clostridium phytofermentans lisados ​​de células enteras. Primero cuantificamos el etiquetado de eficiencia Redi de una mezcla de C. phytofermentans lisados ​​de proteínas a partir de celulosa culturas (pesada etiqueta, H) y glucosa (etiqueta de la luz, L). Cuando se filtra a un péptido falso descubrimiento tasa del 1%, la muestra contenía 11.194 secuencias de péptidos ?...

Discusión

Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Eti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips