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Method Article
還元ジメチル化(REDIラベリング)によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。
還元ジメチル化(ラベリングのRedi)によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に(光)または重水素化(重)の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相(BPRP)クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。
複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています。15 N標識の1やSILAC 2 ICAT 3、のiTRAQ 4、還元ジメチル化5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化(ラベリングのRedi)は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。
REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素( 図1)を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光」ラベルでサンプル1中のペプチドをメチル化。光、質量分析計を用いて二つの形態間を区別するために使用される重質形態との間の6.0377 Daの質量差ペプチドの結果についての各ジメチル化アミノ基である。具体的には、ペプチドの相対存在量は、光のMS1抽出イオンクロマトグラムの面積の比(MS1ピーク面積比)と各ペプチドイオン対についての重鎖バージョンとして定量化される。タンパク質の相対存在量は、タンパク質中の全てのペプチドのうち、中央値MS1のピーク面積比として計算される。本稿では、行動のための堅牢なプロトコルを記述逆相ペプチド固相抽出、オンカラムのRedi標識、ペプチド分画塩基性pH位相(BPRP)クロマトグラフィーを反転し、StageTipsを用いてペプチド混合物を精製し( 図2)を含むLC-MS/MSによってのRedi標識実験をING 。我々は定量的プロテオミクスのためREDIラベルを使用することの利点と制限について説明します。
注:この方法は、以前に12を説明した。
1。タンパク質の単離
好ましくは、フレンチプレス、ビーズビーティング、または超音波のような物理的方法により、細胞を溶解することによって細胞タンパク質1mgを準備します。酵素は、質量分析の測定を混乱されますので、リゾチーム媒介細胞溶解を避けてください。
タンパク質の2。TCA沈殿
タンパク質を沈殿さ10分間氷上で4倍量のタンパク質と寒さに1ボリュームトリクロロ酢酸(TCA)を追加します。 4℃で5分間、12,000×gで遠心分離し、上清を取り除く。 4℃で5分間、12,000×gで氷冷アセトン及び遠心分離機の1ml中にペレットを再懸濁上清を除去し、15分間、ペレットを乾燥させるためにベンチにチューブを反転させる。 -80℃での店舗タンパク質ペレット
3。変性タンパク質ジスルフィド結合を還元
リタンパク質をサスペンド500μlの変性および還元緩衝液中で約2 mg / mlの(50mMのHEPES pH8.5で、5mMのDTT中4 M尿素または3%SDSのいずれか)である。任意選択で、緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。室温で10分間、続いて56℃で30分間、タンパク質をインキュベートする。
4。Aklylate無料スルフヒドリル基が不可逆的ジスルフィド結合の形成を破壊する
水中での新鮮な0.3Mのヨードアセトアミドを準備します。注意!ヨードアセトアミドは、非常に毒性が強い。 500μlのタンパク質に25μlの0.3 Mヨードアセトアミド(15mMの最終濃度)を添加し、室温で暗所に20分間インキュベートする。 300のDTT(5 mMの最終DTT濃度)を10μlを添加することにより、ヨードアセト急冷。 -80℃でアルキル化されたタンパク質を保存する
5。タンパク質消化
TCAは、タンパク質を沈殿させる(工程2に記載のように)および50 mMのHEPES(pHは8.2)1mlを、1 M尿素中で再懸濁する。シルendoproteinの原液を準備し2μgの/μLの濃度のタンパク質溶液に5μLを加え、水中でのASE(のLys-C)。室温で16時間混合物をインキュベートする。最終の確保のLys-C濃度は10ngの/μlのタンパク質と対のLysC比である(w / w)の50分の1〜200分の1である。 、50 mMの酢酸を40μlの20μgのシーケンシンググレードのトリプシンを再懸濁のLys-C消化物に5μL(10μgのトリプシン)を追加し、37℃で6時間インキュベートトリプシンに使用したのLys-Cに同じプロテアーゼ濃度およびプロテアーゼとタンパク質との比を使用してください。
6。逆相ペプチド抽出
7。オンカラム還元ジメチル化によるペプチドの標識(REDIラベリング)
シアン化水素は、ラベリング処理中に低濃度で放出された化学フードの下で、この手順を実行します。
塩基性pH逆相(BPRP)クロマトグラフィー<によって8。セパレートペプチド混合物/ pの>
塩基性pHは、独立して、プロテオームカバー率を増加させるためにLC-MS/MSにより分析する複数の画分へのペプチド混合物を分離するために相(BPRP)クロマトグラフィーを逆転させた。
9。ストップアンドゴーの抽出によって精製し、ペプチド(StageTips)
1.07ミリメートルの内径(ID)が2 C18ディスクを備えた200μlのピペットチップを充填することにより、C18-StageTip 7マイクロカラムを準備します。エッペンドルフチューブにステージのヒントを置く。メタノール130μL、その後130 UL 80パーセントACN、0.5%の酢酸でのヒントを洗浄するためのマイクロを使用しています。 130μlの0.1%TFAでStageTipsを平衡化させます。 StageTipsにペプチド混合物を移し、40μlの0.5%酢酸、その後、40μlの0.1%TFA、その後、130μlの0.1%TFAで洗浄する。 20μlの40%ACN、0.5%酢酸、次いで、20μlの80%ACN、0.5%酢酸を有する第1のペプチドを溶出させる。溶出液A組み合わせるND真空濾過により乾燥させます。
10。マイクロキャピラリーLC-MS/MS
11。、MS / MSデータ収集
これらのパラメータ( 表1)を用いて、このようなSEQUEST 8などのアルゴリズムを用いて理論的なデータベースへのMS / MSスペクトルのRAWファイルを比較することにより、ペプチドを同定。
表1。ペプチドデータベース検索のパラメータを。
一般的なパラメータ | 最大2と完全にトリプシン消化は、切断を逃した |
25 ppmの前駆イオントレランス | |
1.0ダフラグメントイオンの許容範囲 | |
静的な変更 | システイン、カルボキシアミドメチル化に関する57.02146ダ |
リジンおよびペプチドのN末端上28.03130ダ、光ジメチル化ラベル | |
動的変更 | メチオニン、酸化に対する15.99491ダ |
リジンおよびペプチドのN末端、重いジメチル化ラベルに6.03766ダ |
12ペプチドの定量化
計算MS1の重鎖および軽鎖のペアの領域は、イオンクロマトグラム(MS1ピーク面積)およびペプチドシグナル対ノイズ(S / N)比が10を抽出した。ペプチドを含むペアた場合にのみ、その平均信号NOIそれ比は5以上である。同じペプチド(MS1ピーク面積比)の重鎖および軽鎖のバージョンMS1ピーク面積の比が、2つの試料中のペプチドの相対存在量を定量する。タンパク質中の全てのペプチドの中央値MS1ピーク面積比と相対タンパク質量を計算します。
私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース(重ラベル、H)とグルコース(光ラベル、L)の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1%ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98%のRed...
安価な標識試薬(試薬はサンプルあたり1ドル未満のコスト)、速い反応速度(〜10分)、副生成物が存在しない場合、高:いくつかのポイントが還元ジメチル化を使用して、ペプチドの安定同位体標識(REDIラベリング)定量的プロテオミクスのための魅力的な方法を作る再現性( 図3、図4)、安定した反応生成物、任意のプロテアーゼを使用する能力、および標識されたペプチ?...
著者らは、競合する経済的利益や関心のある他の衝突を宣言していません。
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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