Protéomique quantitative à l'aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Résumé

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.

Résumé

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d'expression des protéines entre les échantillons à l'aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l'étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d'ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d'échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l'étiquetage Redi par rapport à d'autres méthodes pour l'incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l'étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l'abondance de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.

Introduction

Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l'utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. ¹⁵ N étiquetage ¹ et ² présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT ^3, iTRAQ ^4, et la réduction diméthylation ⁵ ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.

Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l'échantillon 1 avec une étiquette "lumière" en utilisant des réactifs avec des atomes d'hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l'échantillon 2 avec une étiquette "lourd" en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l'aide d'un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d'ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d'ions peptide. L'abondance relative d'une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 ​​de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l'aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l'utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.

Protocole

NOTE: Cette méthode a déjà été décrite ^12.

Une. Protein Isolation

Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l'enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse.

2. TCA précipitation des protéines

Ajouter de l'acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml d'acétone glacée et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et inverser le tube sur le banc pour sécher le culot pendant 15 min. boulettes de protéines de magasin à -80 ° C.

3. Dénaturer les protéines et réduire les liaisons disulfures

Resuspendre les protéines à ~ 2 mg / ml dans 500 ul de tampon de dénaturation et de réduction (soit 4 M d'urée ou de 3% de SDS à 50 mM d'HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). En option, inclure un inhibiteur de protéase dans la mémoire tampon. Incuber les protéines de 30 min à 56 ° C, suivies de 10 min à température ambiante.

4. Aklylate Groupes sulfhydryle libre de perturber de façon irréversible la formation de liaisons disulfures

Préparer une solution fraîche 0,3 M iodacétamide dans l'eau. ATTENTION! Iodoacetamide est hautement toxique. Ajouter 25 ul de 0,3 M d'iodoacétamide (15 mM de concentration finale) et 500 ul de protéine et incuber pendant 20 min à l'obscurité à température ambiante. Étancher iodacétamide en ajoutant 10 ul de 300 mM de DTT (5 mM concentration finale TNT). Stocker des protéines alkylés à -80 ° C.

5. Digestion des protéines

TCA précipiter les protéines (comme décrit dans l'étape 2) et remettre en suspension dans 1 ml de 50 mM de HEPES (pH 8,2), 1 M d'urée. Préparer une solution stock de Lysyl endoproteinase (Lys-C) dans de l'eau à une concentration de 2 ug / ul et ajouter 5 pl de la solution de protéine. Faire incuber le mélange pendant 16 heures à température ambiante. S'assurer que la concentration finale Lys-C est de 10 ng / ul, et le rapport protéine-à-LysC (p / p) est 1/50-1/200. Remettre en suspension 20 ug de trypsine de qualité séquençage dans 40 ul de 50 mM d'acide acétique, 5 ul (10 ug de trypsine) à la digestion par Lys-C et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Utiliser la même concentration de la protéase et les ratios protease-à-protéine pour Lys-C, tel qu'utilisé pour la trypsine.

6. Phase inverse Peptide Extraction

1. On acidifie par addition de peptides de l'acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 0,5% (pH d'≈ 2). Attacher une colonne C18 à un collecteur d'extraction. Utilisez le débit le plus élevé possible pour toutes les étapes sauf le chargement et l'élution des peptides.
2. Colonne d'eau avec 6 ml d'acétonitrile (ACN). Laver la colonne avec 6 ml de 80% d'ACN, 0,1% de TFA, puis s'équilibrer avec 6 ml de TFA 0,1%. Ne pas laisser lecolonne fonctionner à sec entre les étapes.
3. Arrêter la pression de vide et charger 500 ug de peptides sur la colonne à un débit d'environ 1 ml / min. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, sous vide de redémarrage et laver avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec 3 ml de tampon d'acide citrique (0,09 M acide citrique, 0,23 M de Na ₂ HPO _4, à pH 5,5).
   Nota: Les montants élevés de peptides peuvent être marqués, mais la colonne C18 capacité de liaison devraient être au moins deux fois plus élevées que la quantité de peptide pour éviter la perte de l'échantillon.

7. Sur colonne Peptide étiquetage par réductrice diméthylation (PENSER étiquetage)

Effectuez cette étape sous une hotte chimique que le cyanure d'hydrogène est libéré en faible concentration pendant le processus d'étiquetage.

1. Préparer 12 ml de tampons et de PENSER "lourdes" "légères" à la méthylation des amines peptide libre. Tampon de Redi lumière est constituée de 0,8% de formaldéhyde et 0,12 M cyanoborohydrure de sodium portant des atomes d'hydrogène dans le eEIR naturelles distributions isotopiques dans le tampon d'acide citrique. Tampon de Redi lourde est constituée de 0,8% de formaldehyde deutéré et 0,12 M de cyanoborohydrure de sodium deutéré dans un tampon d'acide citrique.
2. Incuber colonne contenant des peptides par addition de 10 ml soit lumineux ou tampons de Redi lourd pour les colonnes contenant des peptides à raison de 1 ml / min et répéter à garantir un étiquetage complet. Laver la colonne avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec de l'acide acétique à 1 ml de 0,5%.
3. Arrêter le vide et éluer les peptides marqués première avec 1 ml de 40% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%, puis avec 1 ml de 80% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5% en utilisant un débit d'environ 0,5 ml / min. Si vous le souhaitez, de mesurer l'efficacité de l'étiquetage des échantillons individuels par spectrométrie de masse avant de mélanger des échantillons lourds et légers (voir «Les résultats représentatifs"). Mélanger 01:01 échantillons peptidiques lourdes et légères marqué pour être quantifiée par spectrométrie de masse.

8. Peptide indépendante Mélange de pH basique de la phase inversée (BPRP) de chromatographie

PH basique en phase inverse (BPRP) chromatographie pour séparer le mélange de peptide en plusieurs fractions, qui sont analysées indépendamment par LC-MS/MS pour augmenter la couverture du protéome.

1. Fractionner le mélange de peptides sur une colonne HPLC C18 en appliquant un gradient de concentration croissante d'ACN dans 10 mM de bicarbonate d'ammonium (pH 8). Commencer avec 5% (v / v) pendant 5 min ACN, augmenter à 35% ACN en 60 min, puis à 90% d'ACN en 1 min. Conserver la CAN de 90% pendant 4 minutes avant de réduire la CAN à 5% de ré-équilibrer la colonne de 9 min. Recueillir 96 fractions de volume égal à une plaque de 96 puits (A1 à H12). Surveiller le fractionnement à l'aide d'un détecteur UV à 220 nm tandis que les peptides sont élution de la colonne (10 à 70 min dans les conditions décrites ici).
2. Combiner les fractions à partir de puits A1, C1, E1, et G1 (fraction A1), à partir de puits B1, D1, F1, H1 et (fraction B1), à partir de puits A2, C2, E2, et G2 (fraction A2) et en conséquence pour l' fractions restantes. Retirez le solvent en utilisant une centrifugeuse sous vide. peptides Remettre en suspension de fractions A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 et B12 dans 130 pi de 1 M urea/0.5% de TFA et purifier l'aide StageTips comme décrit à l'étape 9. magasin fractions B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 et A12 à -20 º C.

9. Purify peptides par Stop and Go Extraction (StageTips)

Préparer C18-StageTip ⁷ microcolonnes par emballage 200 conseils ul de pipettes avec deux C18 disques avec un diamètre interne (ID) de 1,07 mm. Mettez étape Conseils dans des tubes Eppendorf. Utilisez une micro à laver astuces avec 130 ul de méthanol, puis 130 ul de 80% d'ACN, l'acide acétique à 0,5%. Equilibrer StageTips avec 130 ul de 0,1% de TFA. Transfert mélange de peptides à StageTips et laver avec 130 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul d'acide acétique à 0,5%. Éluer les peptides d'abord avec 20 ul de 40% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%, puis 20 ul de 80% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%. Combinez éluats unend sec par filtration sous vide.

10. Microcapillaire LC-MS/MS

1. Dissoudre dans peptides 1-5 ul d'acide formique à 5%, 5% de ACN à une concentration d'environ 1 pg / pl. Résoudre ~ 1 pg peptides sur une 100 um x 20 cm C18-inversés colonne de HPLC en phase avec un gradient de 6-22% d'ACN dans de l'acide formique 0,125% appliqué sur 75 ou 100 min à un débit de ~ 300 nl / min.
2. Identifier des peptides en utilisant un Orbitrap Velos LTQ ¹² ou liquide similaire plate-forme de spectrométrie de masse chromatographie avec un spectromètre de masse offrant haute résolution et haute précision de masse. Fonctionner le spectromètre de masse en mode dépendant des données avec un plein MS balayage (résolution de 60000) acquise dans l'analyseur Orbitrap. Générer piège à ions linéaire spectres MS / MS pour les 20 ions les plus abondants détectés dans le spectre MS plein. Régler la commande automatique de gain (AGC) de cibles à 1 x 10 ⁶ pour la pleine MS et 2000 pour MS / MS. Réglez durées maximales d'accumulation d'ions à 1000 mspour MS et 150 ms pour MS / MS. Exclure ions précurseurs de peptides fragmentés de sélection supplémentaire à partir de MS / MS pour 20-60 sec.

11. Acquisition de données MS / MS

Identifier des peptides en comparant les fichiers RAW spectres MS / MS à une base de données théoriques avec un algorithme tel que SEQUEST ⁸ à l'aide de ces paramètres (tableau 1).

Tableau 1. Peptidiques Base de données Paramètres de recherche.

Paramètres généraux	digestion trypsique entièrement avec jusqu'à deux clivages raté
	25 ppm d'ions précurseur tolérance
	1,0 Da fragment tolérance d'ions
Modifications statiques	57,02146 Da sur la cystéine, carboxyamidomethylation
	28,03130 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l'étiquette de diméthylation lumière
Modifications dynamiques	15,99491 Da sur la méthionine, l'oxydation
	6,03766 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l'étiquette de diméthylation lourde

1. Filtrer les peptides à un taux de faux positifs de 1% avec un procédé tel que le ^9-stratégie de cible leurre en utilisant une base de données des cadres de lecture ouverts dans les orientations réelles et inversés.

12. Peptide Quantification

Calculer les domaines de paires lourdes et légères de MS1 extraits ion chromatogrammes (zones de pointe MS1) et le peptide signal-sur-bruit (S / N) ¹⁰ rapports. Inclure paires peptidiques lorsque leur moyenne signal-noirapport est supérieur à cinq soi. Quantifier l'abondance relative d'un peptide dans les deux échantillons en tant que le rapport des aires des pics des versions MS1 lourdes et légères de la même peptide (MS1 de rapport de surface de pic). Calculer l'abondance relative de la protéine comme étant le rapport de la MS1 surface du pic médian de tous les peptides dans la protéine.

Résultats

Nous avons évalué l'exactitude, la précision et la reproductibilité de l'étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d'abord quantifié l'étiquetage efficacité de Redi d'un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet ...

Discussion

Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d'étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l'absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande effica...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips