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Method Article
Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.
Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d'expression des protéines entre les échantillons à l'aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l'étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d'ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d'échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l'étiquetage Redi par rapport à d'autres méthodes pour l'incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l'étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l'abondance de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.
Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l'utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. 15 N étiquetage 1 et 2 présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT 3, iTRAQ 4, et la réduction diméthylation 5 ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n'importe quel type d'échantillon.
Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l'échantillon 1 avec une étiquette "lumière" en utilisant des réactifs avec des atomes d'hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l'échantillon 2 avec une étiquette "lourd" en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l'aide d'un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d'ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d'ions peptide. L'abondance relative d'une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l'aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l'utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.
NOTE: Cette méthode a déjà été décrite 12.
Une. Protein Isolation
Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l'enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse.
2. TCA précipitation des protéines
Ajouter de l'acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml d'acétone glacée et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et inverser le tube sur le banc pour sécher le culot pendant 15 min. boulettes de protéines de magasin à -80 ° C.
3. Dénaturer les protéines et réduire les liaisons disulfures
Resuspendre les protéines à ~ 2 mg / ml dans 500 ul de tampon de dénaturation et de réduction (soit 4 M d'urée ou de 3% de SDS à 50 mM d'HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). En option, inclure un inhibiteur de protéase dans la mémoire tampon. Incuber les protéines de 30 min à 56 ° C, suivies de 10 min à température ambiante.
4. Aklylate Groupes sulfhydryle libre de perturber de façon irréversible la formation de liaisons disulfures
Préparer une solution fraîche 0,3 M iodacétamide dans l'eau. ATTENTION! Iodoacetamide est hautement toxique. Ajouter 25 ul de 0,3 M d'iodoacétamide (15 mM de concentration finale) et 500 ul de protéine et incuber pendant 20 min à l'obscurité à température ambiante. Étancher iodacétamide en ajoutant 10 ul de 300 mM de DTT (5 mM concentration finale TNT). Stocker des protéines alkylés à -80 ° C.
5. Digestion des protéines
TCA précipiter les protéines (comme décrit dans l'étape 2) et remettre en suspension dans 1 ml de 50 mM de HEPES (pH 8,2), 1 M d'urée. Préparer une solution stock de Lysyl endoproteinase (Lys-C) dans de l'eau à une concentration de 2 ug / ul et ajouter 5 pl de la solution de protéine. Faire incuber le mélange pendant 16 heures à température ambiante. S'assurer que la concentration finale Lys-C est de 10 ng / ul, et le rapport protéine-à-LysC (p / p) est 1/50-1/200. Remettre en suspension 20 ug de trypsine de qualité séquençage dans 40 ul de 50 mM d'acide acétique, 5 ul (10 ug de trypsine) à la digestion par Lys-C et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Utiliser la même concentration de la protéase et les ratios protease-à-protéine pour Lys-C, tel qu'utilisé pour la trypsine.
6. Phase inverse Peptide Extraction
7. Sur colonne Peptide étiquetage par réductrice diméthylation (PENSER étiquetage)
Effectuez cette étape sous une hotte chimique que le cyanure d'hydrogène est libéré en faible concentration pendant le processus d'étiquetage.
8. Peptide indépendante Mélange de pH basique de la phase inversée (BPRP) de chromatographie
PH basique en phase inverse (BPRP) chromatographie pour séparer le mélange de peptide en plusieurs fractions, qui sont analysées indépendamment par LC-MS/MS pour augmenter la couverture du protéome.
9. Purify peptides par Stop and Go Extraction (StageTips)
Préparer C18-StageTip 7 microcolonnes par emballage 200 conseils ul de pipettes avec deux C18 disques avec un diamètre interne (ID) de 1,07 mm. Mettez étape Conseils dans des tubes Eppendorf. Utilisez une micro à laver astuces avec 130 ul de méthanol, puis 130 ul de 80% d'ACN, l'acide acétique à 0,5%. Equilibrer StageTips avec 130 ul de 0,1% de TFA. Transfert mélange de peptides à StageTips et laver avec 130 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul d'acide acétique à 0,5%. Éluer les peptides d'abord avec 20 ul de 40% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%, puis 20 ul de 80% d'ACN, de l'acide acétique à 0,5%. Combinez éluats unend sec par filtration sous vide.
10. Microcapillaire LC-MS/MS
11. Acquisition de données MS / MS
Identifier des peptides en comparant les fichiers RAW spectres MS / MS à une base de données théoriques avec un algorithme tel que SEQUEST 8 à l'aide de ces paramètres (tableau 1).
Tableau 1. Peptidiques Base de données Paramètres de recherche.
Paramètres généraux | digestion trypsique entièrement avec jusqu'à deux clivages raté |
25 ppm d'ions précurseur tolérance | |
1,0 Da fragment tolérance d'ions | |
Modifications statiques | 57,02146 Da sur la cystéine, carboxyamidomethylation |
28,03130 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l'étiquette de diméthylation lumière | |
Modifications dynamiques | 15,99491 Da sur la méthionine, l'oxydation |
6,03766 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l'étiquette de diméthylation lourde |
12. Peptide Quantification
Calculer les domaines de paires lourdes et légères de MS1 extraits ion chromatogrammes (zones de pointe MS1) et le peptide signal-sur-bruit (S / N) 10 rapports. Inclure paires peptidiques lorsque leur moyenne signal-noirapport est supérieur à cinq soi. Quantifier l'abondance relative d'un peptide dans les deux échantillons en tant que le rapport des aires des pics des versions MS1 lourdes et légères de la même peptide (MS1 de rapport de surface de pic). Calculer l'abondance relative de la protéine comme étant le rapport de la MS1 surface du pic médian de tous les peptides dans la protéine.
Nous avons évalué l'exactitude, la précision et la reproductibilité de l'étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d'abord quantifié l'étiquetage efficacité de Redi d'un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet ...
Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d'étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l'absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande effica...
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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