Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Resumo

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Resumo

Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados ​​por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Introdução

Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. ^15N rotulagem ¹ e ² SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT ^3, iTRAQ ^4, e redução dimetilação ⁵ adicionar tags de isótopos estáveis ​​após a extracção de proteína e de digestão. Entre esses métodos, dimetilação redutora (rotulagem Redi) está ganhando popularidade como um método barato e reprodutível para quantificar as diferenças de concentração de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Rotulagem Redi envolve péptidos que reagem com o formaldeído, para formar uma base de Schiff, a qual é então reduzidapor cianoborohidreto. Esta reacção dimethylates grupos amino livres no terminal N e cadeias laterais de lisina e monomethylates prolinas N-terminais. O protocolo aqui descrito metila péptidos em amostra 1 com um rótulo de "luz" usando reagentes com átomos de hidrogénio na sua distribuição isotópica natural e a amostra 2, com um rótulo "pesada" usando formaldeído deuterado e cianoborohidreto (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado sobre um péptido resulta numa diferença de massa de 6,0377 Da entre luz e formas, pesados, que são utilizados para distinguir entre as duas formas, utilizando um espectrómetro de massa. Especificamente, as abundâncias relativas de péptidos são quantificadas como a razão entre as áreas de cromatogramas de iões MS1 extraídos (MS1 razão de área de pico) da luz e da versão pesada para cada par de iões de péptidos. A abundância relativa de uma proteína é calculada como a razão da área do pico MS1 média entre todos os péptidos da proteína. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo robusto para condutaing Redi experiências de marcação por LC-MS/MS, que inclui o péptido de extracção de fase reversa em fase sólida, marcação Redi na coluna, o péptido de fraccionamento por pH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia, e purificação de misturas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Discutimos vantagens e limitações do uso de rotulagem Redi para proteômica quantitativa.

Protocolo

NOTA: Este método foi descrito anteriormente ^12.

1. Isolamento de Proteínas

Prepare 1 mg de proteína celular por lise das células, de preferência, por meio de métodos físicos, tais como a prensa francesa, grânulo batimento, ou de ultra-sons. Evitar a lise celular mediada por lisozima porque a enzima irá confundir medições de espectrometria de massa.

2. Precipitação de TCA de Proteínas

Adicionar 1 volume de ácido tricloroacético (TCA) a proteína de 4 volumes e frio em gelo durante 10 min para precipitar as proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de acetona gelada e centrifugar a 12000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e inverter o tubo no banco para secar o sedimento durante 15 minutos. Peletes de proteína Armazenar a -80 ° C.

3. Desnaturar proteínas e Reduzir dissulfeto Bonds

Resuspender as proteínas para ~ 2 mg / ml em 500 ul de tampão de desnaturação e de redução (ou ureia 4 M ou 3% de SDS em 50 mM de HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). Opcionalmente, incluem um inibidor da protease no buffer. Incubar as proteínas durante 30 minutos a 56 ° C, seguido de 10 min à temperatura ambiente.

4. Aklylate grupos livres Sulfidrila para interromper irreversivelmente Formação Dissulfeto de Bond

Prepare fresco 0,3 M iodoacetamide na água. ATENÇÃO! Iodoacetamida é altamente tóxico. Adicionar 25 ul de 0,3 M iodoacetamida (15 mM de concentração final) a 500 ul de proteína e incubar durante 20 min no escuro à temperatura ambiente. Extingue-se por adição de iodoacetamida 10 ul de 300 mM DTT (5 mM de concentração final de DTT). Armazenar proteínas alquiladas a -80 ° C.

5. Digestão de proteínas

TCA precipitar as proteínas (tal como descrito na etapa 2) e ressuspender em 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de ureia. Prepare uma solução estoque de Lisil endoproteinase (Lys-C) em água a uma concentração de 2 mg / mL e adicionam-se 5 ul da solução de proteína. Incubar a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente. Assegurar a concentração final Lys-C é de 10 ng / mL e a relação de proteína para LysC (w / w) é de 1/50 a 1/200. Ressuspender 20 ug de tripsina de grau de sequenciação em 40 ul de 50 mM de ácido acético, adicionam-se 5 uL (10 ug de tripsina) a Lis-C digest, e incubar durante 6 horas a 37 ° C. Usar a mesma concentração de protease e os rácios de protease-proteína para Lis-C, tal como utilizado para a tripsina.

6. De fase inversa Peptide Extracção

1. Acidifica-se péptidos por adição de ácido trifluoroacético (TFA) até uma concentração final de 0,5% (pH ≈ 2). Anexar uma coluna C18 de um colector de extração. Utilize a maior taxa de fluxo possível para todos os passos excepto a carga e eluição dos peptídeos.
2. Wet coluna com 6 ml de acetonitrila (ACN). Lavar coluna com 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, em seguida equilibrar-se com 6 ml de TFA a 0,1%. Não permita que ocoluna para secar entre as etapas.
3. Pare a pressão de vácuo e carregar 500 ug de péptidos para a coluna a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 ml / min. Uma vez que os péptidos se ligaram à coluna, a reinicialização vácuo e lavar com 6 mL de TFA a 0,1%, em seguida com 3 ml de tampão de ácido cítrico (ácido cítrico 0,09 M, 0,23 M de Na ₂ HPO _4, pH 5,5).
   Nota: os valores mais elevados de péptidos podem ser marcados, mas a coluna C18 capacidade de ligação deve ser pelo menos duas vezes maior do que a quantidade de péptido para evitar a perda de amostra.

7. On-coluna Peptide Labeling por redutora dimetilação (Redi Labeling)

Execute esta etapa sob um capuz químico como cianeto de hidrogênio é liberado em baixa concentração durante o processo de rotulagem.

1. Prepare 12 ml de "leves" e "pesados" buffers REDI de metilato aminas peptídeo livres. Tampão Redi Luz consiste de 0,8% de formaldeído e 0,12 M cianoborohidreto de sódio levando hidrogênios em poeir distribuições isotópicas naturais em tampão de ácido cítrico. Tampão Redi pesada consiste em 0,8% de formaldeído deuterado e 0,12 M deuterado cianoborohidreto de sódio em tampão de ácido cítrico.
2. Incubar coluna contendo peptídeos por adição de 10 ml ou de luz ou de tampão Redi pesada para as colunas contendo péptidos em taxa de fluxo de 1 ml / min e repetir a assegurar a rotulagem completa. Lavar a coluna com 6 ml de TFA a 0,1% e, em seguida, com ácido acético a 1 ml de 0,5%.
3. Pare vácuo e eluir péptidos marcados em primeiro lugar com 1 mL de 40% de ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida com 1 mL de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético, utilizando uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 ml / min. Se desejar, medir a eficiência de marcação de amostras individuais por espectrometria de massa antes de misturar amostras leves e pesados ​​(ver "Os resultados representativos"). Misturar 01:01 amostras de péptidos pesados ​​e etiquetados-luz para ser quantificada por espectrometria de massa.

8. Mistura Peptide separado por pH básico invertida Fase cromatografia (BPRP)

PH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia para separar a mistura de péptidos em várias fracções, que são analisadas de forma independente por LC-MS/MS para aumentar a cobertura do proteoma.

1. Fraccionar a mistura de péptidos numa coluna C18 de HPLC através da aplicação de um gradiente de concentração crescente de ACN em 10 mM de bicarbonato de amónio (pH 8). Comece com 5% (v / v) de ACN durante 5 minutos, para aumentar a 35% de ACN em 60 min, e em seguida a 90% de ACN em 1 min. Reter a ACN 90% durante 4 minutos antes de reduzir o ACN a 5% para re-equilibrar a coluna durante 9 min. Recolha 96 fracções de igual volume de uma placa de 96 poços (de A1 a H12). Monitorar a fraccionamento utilizando um detector de UV a 220 nm, enquanto que os péptidos são eluição da coluna (10-70 min para as condições aqui descritas).
2. Combine frações de poços A1, C1, E1 e G1 (fração A1), a partir de poços B1, D1, F1 e H1 (fração B1), a partir de poços A2, C2, E2 e G2 (fração A2) e, consequentemente, para a demais frações. Remover o solvent usando uma centrífuga de vácuo. Ressuspender a partir de fracções de péptidos de A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, B12 e em 130 ul de 1 M urea/0.5% TFA e purificar usando StageTips como descrito no passo 9. Loja frações B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 e à temperatura de -20 º C.

9. Purify Peptídeos por parar e ir Extraction (StageTips)

Prepare ^C18-7 StageTip microcolunas embalando 200 dicas mL pipeta com duas C18 discos com um diâmetro interno (ID) de 1,07 mm. Coloque Dicas Stage em tubos Eppendorf. Use uma microcentrífuga para lavar dicas com 130 mL de metanol, em seguida, 130 ul de 80% ACN, ácido acético 0,5%. Equilibrar StageTips com 130 mL TFA 0,1%. Transferir a mistura de péptidos de StageTips e lava-se com 130 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de 0,1% de TFA, em seguida, 40 ul de ácido acético a 0,5%. Eluir péptidos primeiro com 20 ul de 40% ACN, 0,5% de ácido acético, em seguida, 20 ul de 80% ACN, 0,5% de ácido acético. Combine um eluatosnd seco por filtração sob vácuo.

10. Microcapilares LC-MS/MS

1. Dissolve-se os péptidos em 1-5 mL de ácido fórmico a 5%, 5% de ACN a uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL. Resolver ~ 1 ug péptidos sobre uma 100 um × 20 cm, C18-invertidos coluna de HPLC de fase com um gradiente de 6-22% de ACN em ácido fórmico a 0,125% aplicados sobre 75 ou 100 min a uma taxa de fluxo de ~ 300 nl / min.
2. Identificar peptídeos usando um LTQ Orbitrap Velos ¹² ou plataforma semelhante cromatografia líquida-espectrometria de massa com um espectrômetro de massa fornecendo alta resolução e precisão de massa de alta. Operar o espectrômetro de massa no modo dependente de dados com uma completa varredura MS (resolução de 60.000) adquirido no analisador Orbitrap. Gerar ion trap linear espectros MS / MS para as 20 mais abundantes iões detectados no espectro de MS completa. Definir controle de ganho automático (AGC) metas para 1 x 10 ⁶ para o pleno MS e 2.000 para MS / MS. Definir máximas vezes acúmulo de íons de 1.000 mspara MS e 150 ms para MS / MS. Excluir íons peptídeo precursor fragmentadas de uma maior seleção de MS / MS para 20-60 seg.

11. MS / MS de Aquisição de Dados

Identificar peptídeos comparando espectros MS / MS arquivos RAW para um banco de dados teóricos com um algoritmo como SEQUEST ⁸ usando esses parâmetros (Tabela 1).

Tabela 1. Peptídeo de banco de dados da pesquisa Parâmetros.

Parâmetros Gerais	digestão totalmente tryptic com até 2 perdeu clivagens
	Tolerância íon precursor ppm 25
	1.0 tolerância íon fragmento Da
Modificações estáticos	Da 57,02146 em cisteína, carboxyamidomethylation
	Da 28,03130 em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação luz
Modificações dinâmicas	Da 15,99491 em metionina, a oxidação
	6,03766 Da em lisina e o péptido N-terminal, a etiqueta dimetilação pesado

1. Filtrar péptidos a uma taxa de detecção falso 1% com um método tal como a estratégia de ^9-alvo chamariz utilizando uma base de dados de estruturas de leitura abertas nas orientações efectivos e invertidas.

12. Peptide Quantificação

Calcular as áreas de pares pesados ​​e leves de MS1 extraído íon cromatogramas (áreas de pico MS1) e peptídeo sinal-ruído (S / N) proporções ^10. Incluir pares de peptídeos somente quando sua média de sinal-noiproporção se for superior a cinco. Quantificar a abundância relativa de um peptídeo das duas amostras como a razão entre as áreas dos picos de MS1 versões pesadas e leves do mesmo péptido (razão de área de pico MS1). Calcular as abundâncias relativas de proteína como a razão da área do pico MS1 mediana para todos os péptidos da proteína.

Resultados

Avaliou-se a exatidão, precisão e reprodutibilidade de rotulagem Redi usando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisados ​​de células inteiras. Primeiro, quantificou o Redi eficiência de marcação de uma mistura de C. phytofermentans lisados ​​de proteína a partir de celulose (pesado marcado, H) e glicose (rótulo de luz, L) culturas. Quando filtrada para uma taxa de falsa descoberta peptídeo 1%, esta amostra continha 11.194 sequências de peptídeos exclusivo...

Discussão

Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips