안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

요약

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

초록

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확하게 질량 분석기를 사용하여 샘​​플 간의 단백질 발현 차이를 정량화하는 방법입니다. REDI 라벨은 각각의 유리 아민에 두 개의 메틸 그룹을 추가하기 위해 정기적 (빛) 또는 포름 알데히드와 나트륨 시아 노보로 하이드 라이드의 중수 (무거운) 양식을 사용하여 수행됩니다. 여기에서 우리는 REDI 표시와 복잡한 단백질 혼합물의 정량 비교를위한 강력한 프로토콜을 보여줍니다. 비교를 위해 단백질 시료는 빛 또는 무거운 메틸 태그, 혼합하고, LC-MS/MS 공동 분석 중 하나를 수행하는 레이블 펩타이드로 분해된다. 상대 단백질의 개체수는 전체 MS 스펙트럼에서 추출 된 성분 펩타이드의 무겁고 가벼운 표시된 버전의 이온 크로마토 그램의 피크 면적을 비교하여 정량화. 여기에서 설명하는 방법은 샘플 역상 고상 추출에 의한 제조, 펩타이드에 열 REDI 라벨, 기본 산도 회전에 의해 펩타이드 분획을 포함ersed 상 (BPRP) 크로마토 그래피 StageTip 펩티드 정제. 우리는 안정 동위 원소의 설립을위한 다른 방법에 대한 REDI 라벨의 장점과 한계에 대해 설명합니다. 우리는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질의 개체수를 비교하는 빠르고, 저렴하고 정확한 방법으로 REDI 라벨을 사용하여 새로운 응용 프로그램을 강조 표시합니다.

서문

복잡한 시료 사이에 많은 단백질의 농도 차이를 측정하는 것은 단백질 체학의 중심 과제이다. 점점이 서로 다른 동위 원소의 태그를 각 샘플에서 단백질을 라벨 샘플을 결합하고, 농도의 차이를 정량화하기 위해 질량 분석기를 사용하여 수행되고있다. 몇 가지 방법은 단백질과 펩타이드의 안정 동위 원소 표지 존재한다. ICAT ^3, iTRAQ ^4, 환원 디메틸 화 ^{5 단백질} 추출 및 소화 후 안정 동위 원소의 태그를 추가하는 반면 ¹⁵ N 표시 ¹ SILAC ^2, 생체 내에서 대사 동위 원소 라벨을 소개합니다. 이러한 방법 중에서, 환원 디메틸 화 (REDI 라벨링)는 샘플의 거의 모든 종류의 단백질 농도 차이를 정량화 할 수있는 저렴하고 재현성있는 방법으로 인기를 얻고있다.

REDI 라벨은 감소 쉬프 기반을 형성하는 포름 알데히드와 반응 펩티드를 포함노보로 하이드 라이드로. 이 반응은 N-말단 및 리신 측쇄 monomethylates 및 N-말단에 프롤린 자유 아미노기를 dimethylates. 여기에 설명 된 프로토콜은 중수 소화 포름 알데히드와 노보로 하이드 라이드 (그림 1)를 사용하여 "무거운"레이블이 자연 동위 원소 분포와 샘플 2의 수소 원자와 시약을 사용하여 "빛"라벨 샘플 1 펩티드를 methylates. 빛과 질량 분석기를 이용하여 두 형태를 구별하기 위해 사용되는 무거운 형태 사이 6.0377 다의 질량 차이로 펩티드 결과의 각 dimethylated 아미노기. 구체적으로는, 상대 펩티드 존재비는 광의 MS1 추출 이온 크로마토 영역 비율 (MS1 피크 면적비) 및 각 펩티드 이온 쌍 무거운 버전으로 정량화된다. 단백질의 상대적인 풍부함이 단백질에있는 펩티드들 중앙값 MS1 피크 면적의 비율로서 계산된다. 이 보고서에서, 우리는 행위에 대한 강력한 프로토콜을 설명역상 펩타이드 고체상 추출에 열 REDI 라벨링, 펩티드 분획 염기성 pH 기준 위상 (BPRP) 크로마토 그래피를 반전하고 StageTips를 이용 펩타이드 혼합물의 정제 (도 2)를 포함 LC-MS/MS에 의해 REDI 라벨링 실험을 보내고 . 우리는 정량 프로테오믹스에 대한 REDI 라벨 사용의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

프로토콜

참고 :이 방법은 이전에 ^12를 설명했다.

1. 단백질 분리

바람직하게는 프랑스어 프레스, 구슬 박동, 또는 초음파 등의 물리적 방법에 의해, 용해하는 세포에 의해 세포 단백질의 1 밀리그램을 준비합니다. 효소 질량 분석 측정을 혼동하기 때문에 라이소자임 - 매개 세포 용해를 방지.

단백질의 2. TCA 강수량

단백질을 침전 10 분 동안 얼음에 4 권의 단백질과 진정으로 1 볼륨 트리클로로 아세트산 (TCA)를 추가합니다. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 12,000 XG에 상층 액을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 12,000 XG에 얼음처럼 차가운 아세톤 및 원심 분리기 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁 상층 액을 제거하고 15 분 동안 펠렛을 건조 벤치에 튜브를 반전. -80 ° C에서 저장 단백질 펠렛

3. 변성 단백질과 이황화 채권을 감소

다시단백질을 중단 500 ㎕의 변성 및 감소 버퍼에 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ (50 mM의 HEPES 산도 8.5, 5 mM의 DTT 4 M 요소 또는 3 % SDS 중 하나)에. 선택적으로, 버퍼에있는 단백질 분해 효소 억제제 (가) 있습니다. 실온에서 10 분 뒤에 56 ° C에서 30 분, 위해 단백질을 품어.

4. Aklylate 무료 설 프히 드릴 그룹은 돌이킬 수 이황화 결합 형성을 방해하는

물에 신선한 0.3 M의 요오도 아세트 아미드를 준비합니다. 주의! 요오도 아세트 아미드는 매우 독성이다. 500 ㎕의 단백질을 25 ㎕의 0.3 M 요오도 아세트 아미드 (15 mM의 최종 농도)를 추가하고 실온에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 300 mM의 DTT (5 mM의 DTT 최종 농도)의 10 μl를 추가하여 요오도 아세트 아미드 끄다. C. -80 ° 알킬화 단백질을 저장

5. 단백질 소화

TCA는 단백질을 침전 (2 단계에 설명 된대로), 50 mM의 HEPES (산도 8.2) 1 ㎖, 1 M 요소의에 resuspend. 리실의 endoprotein의 재고 솔루션을 준비합니다2 ㎍ / μL의 농도와 단백질 용액에 5 μl를 추가 물에 ASE (리스-C). 실온에서 16 시간 동안 혼합물을 배양한다. 최종리스-C 농도가 10 NG / μL 및 단백질 - 투 -의 lysC 비율 (W / W) 1 / 200 ~ 1 / 50입니다 확인합니다. 50 mM의 아세트산의 40 μL에 20 μg 시퀀싱 등급 트립신을 재현 탁리스 - C 다이제스트에 5 μL (10 μg 트립신)를 추가하고, 37 ℃에서 6 시간 동안 배양 트립신에 사용되는리스-C에 대해 같은 단백질 분해 효소의 농도와 단백질 분해 효소 - 투 - 단백질 비율을 사용합니다.

6. 역상 펩타이드 추출

1. 0.5 %의 최종 농도 (산도 ≈ 2)에 트리 플루오로 아세트산 (TFA)를 첨가하여 펩티드를 산성화. 추출 매니 폴드에 C18 컬럼을 연결합니다. 펩티드의로드 및 용출를 제외한 모든 단계에 대한 가장 높은 유량을 사용합니다.
2. 6 ㎖의 아세토 니트릴 (ACN) 젖은 열입니다. 6 ㎖의 80 % ACN, 0.1 % TFA로 열을 세척 한 다음 10 ㎖의 0.1 % TFA와 평형. 허용하지 않음단계 사이에 건조 실행하는 열입니다.
3. 진공 압력을 정지하고 약 1 ㎖ / 분의 유속으로 칼럼에 펩타이드 500 μg를로드. 펩티드는 열, 다시 시작 진공에 바인딩 한 다음 (0.09 M 구연산, 0.23 M 나 ₂ HPO _4, pH를 5.5) 구연산 버퍼의 3 ㎖로, 10 ㎖의 0.1 % TFA로 세척 한 후.
   참고 : 높은 펩티드 량이 표시 될 수 있지만 결합능 C18 컬럼이 적어도 샘플 손실을 피하기 위하여 펩티드 양보다 두 배이어야한다.

7.에 열 환원성 디메틸 화에 의해 펩타이드 라벨링 (REDI 라벨링)

시안화 수소는 레테르를 붙이는 과정에서 낮은 농도로 방출 등의 화학 후드에서이 단계를 수행합니다.

1. 펩타이드 무료 아민을 메틸화하는 "빛"과 "무거운"REDI 버퍼 12 ML을 준비합니다. 밝은 REDI 버퍼는 0.8 %의 포름 알데히드 및​​ 번째에 수소를 운반하는 0.12 M 소듐 사이 아 노보로 하이드 라이드로 구성구연산 버퍼에 EIR 천연 동위 원소의 분포. 무거운 REDI 버퍼는 0.8 % 중수 소화 포름 알데히드와 구연산 완충액에 0.12 M 중수 소화 나트륨 시아 노보로 구성된다.
2. 1 ㎖ / 분의 유속으로 펩티드 함유 컬럼에 10 ㎖의 광 또는 농후 한 Redi 버퍼 하나를 첨가하여 펩티드를 함유하는 컬럼을 부화하고 완전한 라벨링을 위해 반복한다. 워시 6 ㎖의 0.1 % TFA와 열 한 후 1 ㎖의 0.5 % 아세트산.
3. 진공을 중단하고 약 0.5 ㎖ / 분의 유속을 사용하여 다음 1 ㎖의 80 % ACN으로, 0.5 % 초산 1 ml의 40 % ACN, 0.5 % 초산과 제 표지 펩티드​​를 용리 하였다. 원하는 경우, 무겁고 가벼운 샘플을 혼합하기 전에 질량 분석법에 의한 개별 샘플 라벨링 효율을 측정 ( "대표 결과"참조). 질량 분석에 의해 정량화 될 수 1:1 무겁고 가벼운 표지 펩타이드 샘플을 섞는다.

기본 pH를 역상 (BPRP) 크로마토 그래피 <8. 별도의 펩타이드 혼합물/ P>

기본 pH는 독립적으로 프로테옴 범위를 확대하기 위해 LC-MS/MS로 분석되는 여러 개의 분수로 펩타이드 혼합물을 분리하는 단계 (BPRP) 크로마토 그래피를 반전.

1. 10mM의 중탄산 암모늄 (pH가 13)에서 증가 ACN 농도 구배를 적용하여 C18-HPLC 컬럼에서 펩타이드 혼합물을 분별. 5 분 5 % (V / V) ACN 시작, 60 분에 35 % ACN으로 증가하고, 1 분에 다음에 90 % ACN. 9 분 다시 평형 컬럼에 5 % ACN을 감소하기 전에 4 분 동안 90 % ACN을 유지합니다. 96 - 웰 플레이트 (H12에 A1)에 같은 부피의 96 분수를 수집합니다. 펩티드는 열 (여기에 설명 된 조건에 대한 10 ~ 70 분) 떨어져 용출하는 동안 220 nm에서 UV 검출기를 사용하여 분별을 모니터링합니다.
2. 우물 A2, C2, E2, 및 G2 (분수 A2)에서하고 그에 따라 들어, 우물 B1, D1, F1 및 H1 (분수 B1)에서, 우물 A1, C1, E1, 및 G1 (분수 A1)에서 분수를 결합 나머지 분수. solven를 제거진공 원심 분리기를 이용하여 t. 분수에서 재현 탁 펩티드는 A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 및 B12 1 M urea/0.5 %의 TFA의 130 μL와 9 단계에 설명 된대로 StageTips을 사용하여 정제. 저장 분수 B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, -20에서 A12 º C.

9. 정지 및 이동 추출로 정제 펩티드 (StageTips)

1.07 mm의 내부 직경 (ID)와 두 개의 C18 디스크 200 μL 피펫 팁을 포장하여 C18-StageTip ⁷ 마이크로 컬럼을 준비합니다. 에펜 도르프 튜브에 무대 팁을 넣어. 메탄올 130 μL, 다음 130 UL 80 % ACN, 0.5 % 아세트산과 팁을 씻어 마이크로 원심을 사용합니다. (130) 0.1 μL % TFA로 StageTips을 평형. StageTips에 펩티드 혼합물을 전송하고 40 ㎕의 0.5 % 초산 후, 40 ㎕의 0.1 % TFA 후, 130 ㎕의 0.1 % TFA로 세척. 20 ㎕의 40 % ACN, 0.5 % 아세트산, 다음 20 ㎕의 80 % ACN, 0.5 % 아세트산으로 제 펩타이드 용출. 용출액 결합차 진공 여과하여 건조.

10. 마이크로 캐 필러 LC-MS/MS

1. 약 1 ㎍ / ㎕의 농도에 1 ~ 5 ㎕의 5 % 포름산, 5 % ACN의 펩티드를 녹인다. 에서 ~ 1 μg 펩티드를 해결 100 μM × C18 반전 0.125 % 포름산에서 6~22% ACN의 구배로 위상 HPLC 컬럼 ~ 300 NL / 분의 유속으로 75 또는 100 분에 걸쳐 적용될 20cm.
2. LTQ Orbitrap VELOS ⁽¹²⁾ 또는 질량 분석계는 고해상도 및 높은 질량 정확도를 제공하는 것과 유사한 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 플랫폼을 사용하여 펩티드를 식별한다. Orbitrap 분석기에서 획득 한 전체 MS 스캔 (60,000의 해상도)과 데이터 종속 모드에서 질량 분석기를 사용하십시오. 전체 MS 스펙트럼에서 검출 된 20 가장 풍부한 이온 선형 이온 트랩 MS / MS 스펙트럼을 생성합니다. MS / MS에 1 × 10의 전체 MS ⁶ 2,000에 자동 이득 제어 (AGC) 목표를 설정합니다. 1000 밀리 초에 최대 이온 축적 시간을 설정할MS 및 MS / MS 150 밀리 초에 대한. 20 ~ 60 초 동안 MS / MS에서 추가 선택에서 조각난 펩타이드 전구체 이온을 제외합니다.

11. MS / MS 데이터 수집

이러한 매개 변수 (표 1)를 사용하여 같은 SEQUEST ^8과 같은 알고리즘을 이론적으로 데이터베이스에 MS / MS 스펙트럼 RAW 파일을 비교하여 펩티드를 확인합니다.

표 1. 펩타이드 데이터베이스 검색 매개 변수를.

일반 매개 변수	최대 2와 완벽하게 트립신 소화 분열을 놓친
	25 ppm의 전구체 이온 허용
	1.0 다 조각 이온 허용
정적 수정	시스테인, carboxyamidomethylation에 57.02146 다
	라이신과 펩타이드 N-말단에 28.03130 다, 빛 디메틸 화 라벨
동적 수정	메티오닌, 산화에 15.99491 다
	라이신과 펩타이드 N-말단, 무거운 디메틸 화 라벨 6.03766 다

1. 실제와 반대 방향에서 오픈 리딩 프레임의 데이터베이스를 사용하여 이러한 목표 미끼 ⁹ 전략 등의 방법으로 1 %의 거짓 발견 속도에 필터 펩티드.

12. 펩티드 정량

계산 MS1의 중사 슬 및 경 쌍의 영역은 이온 크로마토 그램 (MS1의 피크 면적)을 추출하고, 펩티드 신호 대 잡음 (S / N) 비 ^10. 펩타이드 쌍을 포함하는 경우에만 자신의 평균 신호 - 대 - 노이SE 비율은 다섯 이상입니다. 동일한 펩티드 (MS1 피크 면적비)의 중사 슬 및 경 버전의 MS1의 피크 면적의 비율로서 두 개의 샘플에서 펩티드의 상대적인 풍부함을 계량화한다. 단백질의 모든 펩티드에 대한 평균 MS1의 피크 면적 비율로 상대적으로 단백질의 개체수를 계산합니다.

결과

우리는 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 사용하여 정확도, 정밀도 및 REDI 라벨의 재현성을 평가하고 클로 스트 리듐 속의 세균은 전체 세포 용 해물을 phytofermentans. 우리는 먼저 C의 혼합의 REDI 라벨의 효율성을 정량화 셀룰로오스 (무거운 표시, H)과 포도당 (빛 라벨, L) 문화에서 단백질 해물을 phytofermentans. 1 %의 펩타이드 거짓 발견의 속도로 여과 할 때,이 샘플은 ...

토론

높은 저렴한 라벨 시약 (시약은 샘플 당 1 달러 미만의 비용), 빠른 반응 속도 (~ 10 분), 부산물의 부재 : 몇 가지 점은 양적 proteomics의 매력적인 방법 환원 디메틸 화 (REDI 라벨)를 사용하여 펩티드의 안정 동위 원소 라벨링을 재현성 (도 3,도 4), 안정적인 반응 생성물, 임의의 단백질 분해 효소를 사용하는 능력 및 표지 된 펩티드의 높은 이온화 효율. 이 합성 중간에 특정 아미노산 auxotrop...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips