Количественные протеомика с использованием восстановительного Диметилирование для Стабильный маркировки изотопной

Резюме

Стабильный изотоп маркировка пептидов восстановительным Диметилирование (Реди маркировки) является быстрым, недорогим стратегия для точных масс-спектрометрии на основе количественных протеомики. Здесь мы показываем, надежный метод для подготовки и анализа белковых смесей, используя подход Реди, который может быть применен к почти любого типа образца.

Аннотация

Стабильный изотоп маркировка пептидов путем восстановительного Диметилирование (Реди маркировки) является методом для точного количественного различия экспрессии белка между образцами с использованием масс-спектрометрии. Реди маркировка выполняется с помощью либо обычный (свет) или дейтерированных (тяжелые) формы формальдегида и натрия цианоборогидрида добавить две метильные группы к каждому свободного амина. Здесь мы показываем, надежный протокол для Реди маркировки и количественного сравнения сложных белковых смесей. Образцы белка для сравнения перевариваются в пептиды, маркированные нести легком и тяжелом теги метил, смешиваются и совместно анализировали LC-MS/MS. Относительные распространенности белка количественно путем сравнения ион хроматограмме пиков тяжелых и легких меченых вариантов составного пептида, извлеченной из полного MS спектров. Описанный здесь метод включает пробоподготовки обращенно-фазовой экстракции твердой фазы, в колонку Реди маркировки пептидов, пептидов фракционирование по щелочного рН оборотовersed-фаза (BPRP) хроматографии и StageTip очистка пептида. Мы обсуждаем преимущества и ограничения Реди маркировки в отношении других методов стабильных изотопов регистрации. Мы подчеркиваем новых приложений с использованием Реди маркировке быстрой, недорогой и точный метод для сравнения белковых распространенность в почти любого типа образца.

Введение

Измерение различия концентрации многих белков между сложных образцов является главной задачей, в протеомики. Все чаще это делается путем маркировки белков в каждом образце с разными тегами изотопных, сочетая образцы, и с помощью масс-спектрометрии для количественного различия концентрации. Существует несколько способов для стабильного изотопного мечения белков и пептидов. ¹⁵ N маркировка ¹ и ² SILAC ввести изотопные метки метаболически в естественных условиях, в то время как ICAT ^3, iTRAQ ^4, и снижение Диметилирование ⁵ добавить стабильных изотопов метки после экстракции белка и пищеварения. Среди этих методов, восстановительное Диметилирование (Реди маркировка) набирает популярность как недорогой, воспроизводимый метод для количественного различия концентрации белка в почти любого типа образца.

Реди маркировки включает взаимодействие пептидов с формальдегидом с образованием основани Шиффа, которое затем восстанавливаютцианоборогидрид. Эта реакция dimethylates свободные аминогруппы на N-концах и лизин боковых цепей и monomethylates N-концевых пролинов. Протокол, описанный здесь метилирует пептиды в образце 1 с «легкой» этикетки с использованием реагентов с атомами водорода в их естественной распределения изотопного и образца 2 с «тяжелой» этикетки с использованием дейтерированных формальдегид и цианоборгидрид (рис. 1). Каждый диметилированный аминогруппу на пептида, приводит к разнице масс 6,0377 Da между легкой и тяжелой формы, который используется, чтобы различать между двумя формами с помощью масс-спектрометра. В частности, относительное содержание пептида количественно как отношение MS1, выделенных областей ионных хроматограмм (MS1 отношение площади пика) легкой и тяжелой версии для каждой пары пептид ионов. Относительное содержание белка определяется как отношение средней MS1 площади пика среди всех пептидов в белке. В этом докладе мы описываем надежную протокол для проведенияING Реди маркировки эксперименты по LC-MS/MS что включает в себя пептид твердофазного добычу обращенной фазой, на-колонке Реди маркировку, пептидный фракционирования по щелочного рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии и очистка пептидных смесей с помощью StageTips (рис. 2) . Мы обсудим возможности и ограничения использования Реди маркировку для количественных протеомики.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан ^12.

1. Белок Изоляция

Подготовка 1 мг клеточного белка путем лизиса клеток, предпочтительно с помощью физических методов, таких как французский пресс, кромочная биения, или ультразвуком. Избегать лизоцима-опосредованного лизиса клеток, потому что фермент будет смешивать измерения масс-спектрометрии.

2. TCA Осадки белков

Добавить 1 объем трихлоруксусной кислоты (ТСА) в 4-х томах белка и охладить на льду в течение 10 мин с осаждением белков. Центрифуга при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденного льдом ацетона и центрифуге при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и инвертировать трубку на скамейке, чтобы высушить осадок в течение 15 мин. Белковые магазин гранулы при температуре -80 ° С.

3. Денатурации белков и уменьшить дисульфидных связей

Реприостанавливать белки до ~ 2 мг / мл в 500 мкл буфера денатурации и сокращению (либо 4 М мочевины или 3% SDS в 50 мМ HEPES рН 8,5, 5 мМ DTT). По желанию, включают ингибитор протеазы в буфере. Инкубируют протеины течение 30 мин при 56 ° С, а затем 10 мин при комнатной температуре.

4. Aklylate свободные сульфгидрильные группы необратимо сорвать образование дисульфидной связи

Подготовьте свежий 0,3 M иодацетамидом в воде. ВНИМАНИЕ! Йодацетамид высоко токсичен. Добавить 25 мкл 0,3 М иодацетамида (15 мм конечная концентрация) в 500 мкл белка и инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Гасят добавлением иодацетамида 10 мкл 300 мМ ДТТ (5 мМ DTT конечная концентрация). Храните алкилированные белки при -80 ° С

5. Белок Пищеварение

TCA осадок белки (как описано в шаге 2) и ресуспендируют в 1 мл 50 мМ HEPES (рН 8,2), 1 М мочевины. Подготовка исходного раствора лизил endoproteinASE (Lys-C) в воде при концентрации 2 мкг / мкл и добавить 5 мкл к раствору белка. Выдержите смесь в течение 16 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что конечная концентрация Lys-C 10 нг / мкл, а соотношение белок-к-LysC (вес / вес) 1/50 до 1/200. Ресуспендируют 20 мкг трипсина секвенирования класса в 40 мкл 50 мМ уксусной кислоты, добавляют 5 мкл (10 мкг трипсина) с Lys-C дайджеста, и инкубируют в течение 6 часов при 37 ° С. Используйте ту же концентрацию протеазы и протеазы-на-белка отношения для Lys-C, который используется для трипсина.

6. Обращенно-фазовая Пептид Добыча

1. Подкисляют пептиды добавлением трифторуксусной кислоты (ТФУ) до конечной концентрации 0,5% (рН ≈ 2). Прикрепление колонки С18 в экстракционную коллектора. Используйте максимально возможную скорость потока для всех шагов, кроме погрузки и элюирования пептидов.
2. Влажный колонка с 6 мл ацетонитрила (ACN). Промыть колонку с 6 мл 80% ACN, 0,1% трифторуксусной кислоты, затем уравновешивают 6 мл 0,1% TFA. Не допускайтеколонка всухую между шагами.
3. Стоп давление вакуума и загрузить 500 мкг пептидов на колонку при скорости потока приблизительно 1 мл / мин. После того, как пептиды, связанный с колонки, перезагрузка вакууме и промывают 6 мл 0,1% TFA, а затем 3 мл буфера лимонной кислоты (0,09 М лимонной кислоты, 0,23 М Na ₂ HPO _4, рН 5,5).
   Примечание: Более высокие количества пептидов могут быть помечены но колонка C18 связывающей способности должно быть по крайней мере в два раза выше, чем количество пептида, чтобы избежать потери образца.

7. На-колонке Пептид маркировки восстановительным Диметилирование (Реди Маркировка)

Выполните этот шаг под химической капотом, как цианистый водород выделяется в низкой концентрации в процессе маркировки.

1. Подготовка 12 мл «легких» и «тяжелых» Реди буферов метилировать пептид свободные амины. Свет буфер Реди состоит из 0,8% формальдегида и 0,12 М натрийцианборгидрида балансовой атомов водорода в гоОДП природные распределения изотопные в буфер лимонной кислоты. Тяжелая буфер Реди состоит из 0,8% дейтерированном формальдегида и 0,12 М дейтерированном цианоборгидрида натрия в буфере лимонной кислоты.
2. Столбец, содержащий пептиды Выдержите, добавив 10 мл либо легкие или тяжелые буферных Реди в пептидных содержащих колонны на скорости потока 1 мл / мин и повторить, чтобы обеспечить полное маркировку. Wash колонка 6 мл 0,1% TFA, а затем 1 мл 0,5% уксусной кислоты.
3. Стоп вакуум и элюируют сначала меченых пептидов с 1 мл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 1 мл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты при скорости потока приблизительно 0,5 мл / мин. При желании, измерения эффективности маркировки отдельных образцов методом масс-спектрометрии перед смешиванием тяжелые и легкие образцы (см. "Представитель результаты"). Смешайте 1:01 тяжелые и легкие меченных проб пептидные быть количественно с помощью масс-спектрометрии.

8. Отдельный смеси пептидов по Базовая рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии

Основные рН обращенной фазой (BPRP) хроматографии для разделения смеси пептидов на несколько фракций, которые независимо проанализированных LC-MS/MS увеличить охват протеома.

1. Фракционирования смеси пептидов на колонке C18-ВЭЖХ с применением градиента возрастающей концентрации ACN в 10 мМ бикарбоната аммони (рН 8). Начнем с 5% (объем / объем) ACN в течение 5 мин, увеличится до 35% ACN в 60 мин, а затем до 90% ACN в течение 1 мин. Сохранить 90% ACN в течение 4 мин до снижения ACN до 5%, чтобы повторно уравновесить колонку в течение 9 мин. Сбор фракций 96 равным объемом в 96-луночный планшет (A1, чтобы H12). Монитор фракционирование с помощью УФ-детектора при 220 нм в то время как пептиды элюируя из колонки (10-70 мин для условий, описанных здесь).
2. Объедините фракции из колодцев A1, C1, E1, и G1 (фракция А1), из лунки B1, D1, F1, и H1 (фракция B1), из скважин А2, С2, E2 и G2 (фракция А2) и, соответственно, для Остальные фракции. Снимите solvenт с использованием вакуумной центрифуге. Ресуспендируют пептиды из фракций A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, В8, A9, B10, A11, B12 и в 130 мкл 1 М urea/0.5% TFA и очищают с помощью StageTips, как описано в шаге 9. Магазин фракции В1, А2, В3, A4, B5, A6, В7, А8, В9, А10, В11 и А12 при -20 ° С.

9. Purify Пептиды по остановиться и пойти Добыча (StageTips)

Подготовка С18-StageTip ⁷ Микроколонки по упаковке 200 советов мкл пипетки с двух С18 дисков с внутренним диаметром (ID) 1,07 мм. Положите Stage Советы в пробирки Эппендорф. Использование микроцентрифуге мыть советы с 130 мкл метанола, затем 130 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Равновесие StageTips с 130 мкл 0,1% TFA. Передача пептидную смесь до StageTips и промывают 130 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,1% TFA, а затем 40 мкл 0,5% уксусной кислоты. Элюции пептиды сначала с 20 мкл 40% ACN, 0,5% уксусной кислоты, затем 20 мкл 80% ACN, 0,5% уксусной кислоты. Комбинат элюатый сухой вакуумной фильтрацией.

10. Микрокапиллярной ЖХ-МС/МС

1. Растворить пептиды в 1-5 мкл 5%-ной муравьиной кислоты, 5% ACN в концентрации приблизительно 1 мкг / мкл. Разрешать ~ 1 мкг пептидов на 100 мкм × 20 см C18-обращенно-фазовой колонки ВЭЖХ с градиентом 6-22% ACN в 0,125% муравьиной кислоты, применяемые в течение 75 или 100 мин при скорости потока ~ 300 Нл / мин.
2. Определить пептиды с помощью LTQ Orbitrap Velos ¹² или аналогичный жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии платформу с масс-спектрометр обеспечить высокое разрешение и высокую точность массовое. Используйте масс-спектрометра в режиме данных зависит от с полным МС сканирования (разрешение 60000) приобретенной в анализаторе Orbitrap. Создать линейного захвата ионов MS / MS спектры для 20 наиболее распространенных ионов, обнаруженных в полном спектре MS. Установите автоматическую регулировку усиления (АРУ) Цели 1 х 10 ⁶ для полного МС и 2000 для MS / MS. Установить максимальное время накопления ионов до 1000 мсдля РС и 150 мсек для MS / MS. Исключить фрагментированные ионы пептид прекурсоров из дальнейшего отбора от MS / MS для 20-60 сек.

11. MS / MS сбора данных

Идентификации пептидов путем сравнения MS / MS спектры RAW файлов в теоретической базы данных с помощью алгоритма, такого как SEQUEST ⁸ с использованием этих параметров (табл. 1).

Таблица 1. Пептид базы данных по Параметры поиска.

Общие параметры	полностью триптического пищеварения с до 2 пропустил раскол
	25 частей на миллион предшественником толерантность ионный
	1.0 Da фрагмент толерантность ионный
Статические Модификации	57,02146 Da на цистеин, carboxyamidomethylation
	28,03130 Da на лизин и пептидной N-концом, свет этикетки Диметилирование
Динамические Модификации	15,99491 Da на метионина, окисление
	6,03766 Da на лизин и пептидной N-концом, тяжелой этикетке Диметилирование

1. Фильтровать пептиды до 1% ложных открытий с таким методом, в качестве целевого-приманка ⁹ стратегии, используя базу данных открытых рамок считывания в фактических и обратной ориентации.

12. Пептид Количественное

Рассчитать области тяжелой и легкой пар MS1 извлечены ионные хроматограммы (пиков MS1) и сигнальный пептид-шум (S / N) отношения ^10. Включите пептидные пар только тогда, когда их средняя сигнал-НойСоотношение себе выше пяти. Количественная относительное обилие пептида в двух образцах, как отношение MS1 пиков тяжелых и легких версий одного и того же пептида (MS1 соотношении площадь пика). Рассчитать относительные белка распространенность в виде среднего коэффициента MS1 площади пика для всех пептидов в белке.

Результаты

Мы оценили точность, точность и воспроизводимость Реди маркировки с помощью Saccharomyces CEREVISIAE и Clostridium phytofermentans Клеточные лизаты. Мы сначала количественно Реди эффективность маркировки смеси С. phytofermentans белковых лизатов из целлюлозы (тяжелый помечены, H) и глюкозы (светло этик...

Обсуждение

Несколько точек сделать стабильным изотопом маркировки пептидов с использованием привлекательным методом для количественных протеомики восстановительное Диметилирование (Реди маркировки): недорогие реагенты маркировки (реагенты стоить менее $ 1 на образец), высокая скорость реакци?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips